张玉婕， 闫承慧， 朱 男， 张效林， 赵 昕， 韩雅玲

高血压是由多个环境因素和遗传因素相互作用的结果［1-2］，在环境因素和遗传基因共同影响下，已经成为影响全球三分之一成人的严重公共卫生问题和沉重负担。盐作为高血压发病的主要环境因素之一，始终备受人们关注。

大量的证据显示高血压与氧化应激相关［3-5］，氧化应激产物促使内皮功能紊乱［6-7］和血管损伤［8］。在血管中的活性氧诱导内皮功能紊乱、血管平滑肌增殖、收缩性增加、脂质氧化、单核细胞浸润、炎症和基质蛋白聚集，导致血管改变，最终形成高血压血管病［9-10］。

在基础［11］和临床［12］研究中显示高盐饮食能够增加氧化应激，在盐敏感高血压个体中尤为明显。即使在盐负荷后血压没有显著提高，盐敏感性依然可以引起靶器官(例如心脏和肾脏)结构和功能的损害［13］。除了对心脏和肾脏的影响，高盐也能够诱导非血压依赖的动脉血管结构和功能的改变［14］，例如胸主动脉、颈动脉、股动脉和肠系膜上动脉等血管改变，但目前尚无高盐对冠状动脉影响的相关研究。

既往研究证实高盐摄入能够导致心血管损害，补钾能够抑制这种损害［15］。例如，高盐摄入能够降低Dahl盐敏感高血压大鼠的生存率，而补钾能够缓解盐诱导的生存率降低，这很可能与补钾对心血管的保护作用相关［16-17］。Ma等［18-19］指出髙钾摄入能够抑制多种血管损伤模型中新生内膜的形成，例如球囊损伤后的大鼠颈动脉及猪冠状动脉。此外，饮食钾不仅能够降低血压，还能够抑制血管平滑肌细胞的增殖［20］和迁移［21］，但饮食钾对血管保护的调节因素还没有被阐明。本研究探讨高盐摄入能否引起冠状动脉结构和功能的改变，以及补钾后能否缓解高盐引起的冠状动脉结构和功能的改变。

材料和方法

1 材料

抗内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)和gp91多克隆抗体均购自Sigma;一氧化氮测试盒及丙二醛(malondialdehyde，MDA)测试盒购自南京建成生物工程有限公司;二氢乙啶(dihydroethidium，DHE)荧光探针及辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗购自中杉金桥生物公司;蛋白印迹发光试剂购自Amersham。

2 方法

2.1 动物分组 取4周龄SD大鼠30只，随机分为正常对照组(NS)、高盐组(HS)和高盐补钾组(HS+HP)，每组各10只。正常对照组给予蒸馏水，高盐组给予含1.5%NaCl的蒸馏水，高盐补钾组给予含1.5%NaCl和0.5%KCl的蒸馏水，各组均干预16周。实验终止前1 d，将SD大鼠置于新陈代谢笼中，搜集24 h尿液用于分析尿钠。实验终止时，10% 水

合氯醛经腹腔注射麻醉动物。分离左侧颈动脉周围组织，剪断左侧颈总动脉并采血。开胸后分离心脏用于形态学和免疫荧光染色分析。

2.2 各组SD大鼠血压的测定 将大鼠放入固定器内，全身加热。加热温度设置在37℃。将加压尾套套在鼠尾合适的位置。大鼠适应环境约10 min后，测量收缩压，连测3次，取其平均值作为一个测量值。所有测量均是在下午进行，以减少因生理节律造成的波动。

2.3 HE染色观察各组大鼠冠状动脉的改变 将标本在3% 多聚甲醛中固定4 h，PBS清洗，然后置于7.5% 蔗糖PBS溶液4℃过夜;将心脏切为每段1 cm，固定于OTC中;置于冰冻切片机中，切片厚度为5 μm;进行HE染色。血管图像分析:在光镜下观察冠状动脉的形态。在20倍和63倍物镜下将完整的血管横切面HE染色图像摄入计算机图像分析系统中。用Image-Pro Plus 6.0分析冠脉动脉管壁厚度、管壁面积/管腔面积的比。

2.4 免疫荧光染色观察各组大鼠冠状动脉的eNOS表达 取不同组中SD大鼠的心脏，行冰冻切片，进行eNOS免疫荧光染色。PBS溶液冲洗3次，每次5 min;山羊血清封闭1 h，阻断非特异性着色;每张切片滴Ⅰ抗(稀释倍数 1∶100)30 μL，4 ℃过夜;PBS 溶液冲洗3次，每次5 min;室温下荧光标记Ⅱ抗孵育2 h;PBS溶液冲洗3次，每次5 min;DAPI染核5～8 s;PBS溶液冲洗3次，每次5 min;用封片液进行封片;荧光显微镜下观察，拍照。

2.5 DHE荧光探针染色 染液稀释后浓度为10 μmol/L，滴定到冰冻切片上30 μL，37℃避光孵育10 min;孵育结束后，用新鲜溶液清洗冰冻切片;显微镜下观察，拍照。

2.6 Western blotting检测gp91在大鼠冠状动脉的表达 采用BCA比色法测量大鼠冠状动脉提取物中蛋白的浓度，使各组中蛋白浓度相一致，用Eppendorf管分装，每管40 μL在－80℃冰箱中冻存;样品在8%或10%分离胶中行SDS-PAGE电泳，每条泳道上样25 μL;转膜;5%脱脂奶粉室温封闭1 h;TBS-T洗膜5次，每次10 min;加入Ⅰ抗(1∶1 000稀释)，4℃孵育过夜;TBS-T洗膜5次，每次10 min;加入Ⅱ抗(1∶2 000稀释)室温孵育2 h;TBS-T洗膜5次，每次10 min;进行显色，胶片曝光成像。

2.7 硝酸还原酶法测定大鼠血清中NO水平 收集各组大鼠血清，采用硝酸还原酶法，按试剂盒说明书操作，测定标准品和样品的540 nm波长的吸光度值，按公式［NO含量(μmol/L)=(测定管吸光度－空白管吸光度)/(标准管吸光度－空白管吸光度)×标准品浓度×样本测试前稀释倍数］计算血清中NO的代谢产物NOx－(包括 NO3－和NO2－)含量，以此代表NO的产量，其中样品具有复孔，添加2次，取均值。

2.8 硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA)法测定大鼠血清中MDA的水平 收集各组大鼠血清，采用TBA法，按试剂盒说明书操作，测定标准品和样品的540 nm波长的吸光度值，按公式［血清中MDA含量(μmol/L)=(测定管吸光度－空白管吸光度)/(标准管吸光度－空白管吸光度)×标准品浓度×样本测试前稀释倍数］计算血清中MDA含量，其中样品具有复孔，添加2次，取均值。

3 统计学处理

计量资料用均数±标准误(mean±SEM)表示，用SPSS 17.0统计软件对各组数据进行正态性及方差齐性检验，然后用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 高盐摄入诱导SD大鼠血压升高及冠状动脉重塑

在HS组中，大鼠血钠和尿钠较NS组大鼠显著升高(P＜0.05)，见表1。提示盐负荷成功。盐负荷16周HS组中约70%的大鼠血压显著升高，根据HS组SD大鼠血压分布情况将其分为盐敏感大鼠和盐抵抗大鼠，其中盐敏感大鼠为后续实验中的HS组大鼠;盐抵抗大鼠因实验过程中血压无明显升高，在本实验中被剔除，用于其它研究。

表1 各组大鼠的数据比较Table 1.Compiled data of the animals with different treatments(Mean±SEM.n=5)

如图1A所示，随着盐负荷时间的延长，HS组大鼠的血压逐渐升高，盐负荷5周前血压较正常组无明显差异，盐负荷6周后血压较正常组显著增加。4周血压增加至(120.1±3.3)mmHg，处于高血压前期I级;10周以后血压显著增加至(131.2±3.8)mmHg，为高血压前期II级。盐负荷16周时，HS组SD大鼠收缩压为(135.7±2.9)mmHg，较正常组SD大鼠收缩压显著增加29 mmHg(P＜0.05)，见图1B。

如图1C所示，盐负荷16周时，HS组较NS组SD大鼠的冠状动脉管壁厚度及管壁面积与管腔面积比显著增加(P＜0.05)，可见高盐摄入能够诱导SD大鼠血压升高及冠状动脉重塑。

2 高盐诱导SD大鼠冠状动脉氧化应激增加及内皮细胞损伤

盐负荷16周时大鼠冠状动脉内超氧阴离子较对照组明显增多，MDA含量显著增加，且冠状动脉内gp91的表达显著增加，见图2。这提示高盐诱导SD大鼠冠状动脉氧化应激增加。

图3显示盐负荷后大鼠冠状动脉内皮eNOS表达较对照组显著降低，且血清中NO含量显著降低，提示高盐能够诱导SD大鼠冠状动脉内皮细胞损伤。

3 补钾缓解高盐诱导的SD大鼠血压增加和冠状动脉重塑

盐负荷的同时给予补钾治疗，HS+HP组与HS组比大鼠的血钠没有显著差异，但HS+HP组与HS组比大鼠的血钾显著增高(P＜0.05)，提示补钾成功。补钾后可以显著降低高盐摄入诱导的SD大鼠血压的升高［(114.6 ±4.2)mmHg vs(135.7 ±2.9)mmHg，P ＜0.05］，见图1A、B。补钾除了可以显著降低血压外，还可以缓解高盐诱导SD大鼠冠状动脉重塑［管壁厚度:(21.2 ±1.8)μm vs(30.9 ±2.5)μm，P ＜0.05;管壁面积/管腔面积比:0.195 ±0.008 vs 0.271 ±0.017，P ＜0.01］，见图 1C。与此同时，补钾可以缓解高盐诱导SD大鼠血清中NO含量的降低和MDA水平的增加，见图2、3。DHE荧光探针染色结果显示，HS组与其它组比，冠状动脉中超氧阴离子显著增加，HS+HP组可以缓解由盐负荷引起的超氧阴离子增加，见图2。

Figure 1.Long-term high salt loading results of the hypertension and the coronary remodeling in salt-loaded rats.A:systolic blood pressure(SBP)monitoring every 2 weeks;B:SBP in the 3 groups after 16-week salt loading;C:HE staining of the coronary artery sections and quantitative analysis of the media thickness and the ratio of coronary artery wall to lumen.Scale bars:50 μm.Mean ± SEM.n=5.*P ＜0.05 vs NS.图1 盐负荷后大鼠血压升高及冠状动脉重塑

讨 论

本研究证实高盐摄入不仅能引起血压升高，还能引起冠状动脉结构和功能的改变，诱导氧化应激增多及内皮细胞损伤，补钾后通过降低氧化应激来缓解高盐引起的有害效应。

既往的研究报道表明，短期高盐饮食并不引起SD大鼠血压的变化［21-22］，然而长期高盐饮食可以诱导SD大鼠血压升高［23-25］。在本实验中，我们发现长期高盐摄入可以诱导大部分SD大鼠(70%)血压升高。高盐干预1～5周时，高盐组大鼠与正常组大鼠血压无明显差异，与既往研究相一致，短期高盐摄入并不影响SD大鼠血压的改变。高盐干预第6周时，大鼠血压开始升高，并随着高盐干预时间的延长，血压进一步升高。补钾后可以缓解由高盐摄入引起的大鼠血压的升高。

Figure 2.Oxidative stress detected in coronary arteries of salt-loaded rats.A:DHE staining for superoxide anion production in coronary arteries at 16 weeks;B:gp91 expression detected by Western blotting;C:serum MDA content detected by thiobarbituric acid method.Scale bars:50 μm.Mean ± SEM.n=5.*P ＜0.05 vs NS.图2 盐负荷后大鼠冠状动脉氧化应激增加

已有人群研究证实，长期高盐饮食可以引起炎症、氧化应激、血管内皮功能障碍、肾损伤、肾脏细胞因子基因表达的改变等，进而引起高血压［26］。长期高盐饮食不但可以引起血压的升高，也可以诱导血管结构发生改变［27］。短期高盐饮食时，并不引起血管结构的改变，但长期高盐饮食时，会发生血管结构的改变，如颈动脉、肠系膜上动脉等，然而，目前尚不清楚是否长期高盐摄入可以引起SD大鼠冠状动脉结构和功能的改变。本研究证实，长期高盐摄入可以引起冠状动脉重塑，管壁厚度和管壁面积/管腔面积比显著增加。补钾后可以缓解由高盐诱导SD大鼠冠状动脉重塑。氧化应激在高血压的发生、发展中发挥着重要作用。高血压动物模型可见血管出现氧化应激，降低血管氧化应激或减少活性氧的产生，可以降低血压［28］。临床研究表明，高血压与血管氧化应激密切相关，给予抗高血压药物可以降低氧化应激的产生。氧化应激主要通过损伤内皮细胞，降低NO释放量，从而减少其血管舒张的作用［29］。在本研究中，长期高盐饮食诱导SD大鼠血钠增加，内皮损伤(血清中NO含量降低，冠状动脉eNOS表达下降)，产生氧化应激(血清中MDA含量显著增加，DHE荧光探针染色发现高盐组大鼠冠状动脉内超氧阴离子增加，Western blotting发现高盐组大鼠冠脉内gp91表达增加)。综上所述，长期高盐饮食，通过激活氧化应激，损伤内皮细胞，减少NO释放量，引起高血压。

既往的研究表明，补钾饮食(含2.1%KCl鼠粮)饲养大鼠，其24 h尿钾含量较正常对照组显著增加，提示补钾成功。标准鼠粮含1.1%KCl，根据大鼠每日饮食量及饮水量估算补钾饮水干预需含0.5%KCl的蒸馏水饲养大鼠，故本研究采用含0.5%KCl的蒸馏水干预大鼠［30］。NADPH氧化酶是血管内生成活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的主要酶体，在外来信号刺激下激活或失活，从而迅速升高或降低细胞内的ROS水平。gp91是NADPH氧化酶的活性亚单位，在电子转移和活性氧族生成中发挥着重要作用。在本研究中，发现补钾后能够降低高盐干预后大鼠冠状动脉内gp91的表达，从而降低NADPH氧化酶的活性来减少氧化应激的生成，进而改善高盐引起的内皮损伤(大鼠血清中NO水平和冠状动脉内eNOS表达恢复正常水平)，起到保护冠状动脉的作用。

本研究提示，建议人们改善生活方式，限制盐饮食并多吃富含钾的蔬菜水果，有助于血压的降低和血管结构及功能的保护，减少心血管疾病的发生率及其危害。

(致谢:真诚感谢沈阳军区总医院指导老师在查阅文献、实验设计及论文写作方面提供的帮助。)

Figure 3.Endothelium damage detected in coronary arteries of salt-loaded rats.A:immunofluorescence staining for eNOS expression in coronary arteries;B:serum NO level detected by nitrate reductase method.Scale bars:50 μm.Mean ± SEM.n=5.*P ＜0.05 vs NS.图3 盐负荷诱导大鼠冠状动脉内皮细胞损伤

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