陈晓华，余小艳，周洁，姜威，胡俊，钟山 ，杨国华

耳聋出生缺陷是影响我国出生人口素质的重要问题之一[1]，2006年12月第二次全国残疾人抽样调查结果显示，耳聋位居我国各类残疾之首，听力残疾者高达2780万，且每年以3万聋儿的新发速度在增长[2]，约60%的先天性耳聋由遗传性因素导致[3]。非综合征性耳聋(non-syndromic hearing impairment，NSHI)占遗传性耳聋的70%，约77%的NSHI为常染色体隐性遗传[4-5]。缝隙连接蛋白2(gap junction protein beta-2，GJB2)基因突变是常染色体隐性遗传听力损失的主要原因之一[6]，约有50%的常染色体隐性遗传NSHI患者存在该基因突变[7]。目前已知的与耳聋有关的GJB2基因突变位点有100多个，其中235delC突变在东亚人群发生频率较高[8]。在耳聋基因诊断的临床工作中，我们发现一个同时携带GJB2 235delC和176-191del16bp的家系，对此家系相关成员的基因型进行了分析，并对孕妇进行产前诊断。

1 资料与方法

1.1 研究对象 样本取自湖北孝感市中心医院妇产科。孕妇(Ι-2)33岁，身体健康，受检时妊娠20周，孕期常规体检未见异常，其第一胎为先证者(Ⅱ-1)，男，7岁，汉族，智力正常，出生后即无听力、无语言能力，心、脑、肾等器官无异常。孕妇丈夫(Ι-1)32岁，身体健康。夫妇二人已育有一子，即为耳聋先证者(Ⅱ-1)，第二胎(Ⅱ-2)胎龄20周，家系谱见图1。

图1 患者家系图Fig. 1 Pedigree of the non-syndromic deafness family

1.2 研究方法

1.2.1 临床听力学检测 对先证者进行电耳镜检查、纯音测听、声导抗检测及颞骨CT扫描检查。以2003年《关于非综合征型遗传性听损伤家系遗传学及听力学描述术语建议案》为耳聋诊断标准，耳聋程度按照两耳中听力较好耳的平均听阈(0.5～4.0kHz听阈的平均值)来评估： ≤20dB HL为正常；20～40dB HL为轻度听力损失；41～70dB HL为中度听力损失；71～95dB HL为重度听力损失；＞95dB HL为极重度听力损失。

1.2.2 家系所有成员GJB2基因型测序及比对

1.2.2.1 基因组DNA抽提 取得该家系成员书面同意后，抽取该家系成员Ι-1、Ι-2、Ⅱ-1外周抗凝血各2ml，应用蛋白酶K法提取白细胞基因组DNA；超声引导下行羊膜腔穿刺术抽取孕妇羊水20ml，无菌培养羊水细胞1周后，应用蛋白酶K法提取羊水细胞基因组DNA。紫外分光光度计进行DNA定量与纯度分析，4℃保存备用。

1.2.2.2 PCR扩增GJB2基因 通过NCBI GenBank查询到GJB2编码区序列，利用Primer 5软件设计引物。上游引物：5'-TTGGTGTTTGCTCAGGAAGA-3'，下游引物：5'-GGCCTACAGGGGTTTCAAAT-3'，产物大小为960bp。应用ABI 9700热循环仪进行DNA扩增。反应体系为：10×Buffer 2.5 μl，dNTP 2.5μl，Taq酶2μl，10μmol/L上下游引物各1 μl，100ng DNA模版1 μl，ddH2O 15μl。反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min，35个循环；72℃延长10min。对扩增后产物行1.5%琼脂糖凝胶电泳粗测，结果显示家系中所有成员均含有GJB2基因(图2)。

图2 家系各成员GJB2基因PCR电泳图Fig.2 GJB2 electrophoresis analysis of the family members

1.2.2.3 PCR产物测序及TA克隆后测序 将PCR扩增产物用快速DNA产物纯化试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)进行纯化，送上海生工(Sangon)生物工程股份有限公司测序。采用上、下游引物双向测序证实的序列变异认定为突变。针对测序图出现的难辨杂峰，对扩增产物进行TA克隆后再挑取单克隆进行测序：将PCR纯化后的扩增产物连接到pMDI8-T载体，连接产物转化大肠埃希菌DH5α，每一产物挑取多个克隆菌落进行培养，收集菌液，抽提质粒进行测序。在多个克隆中同时存在的序列变异认定为突变。

1.3 序列比对 应用Bioedit软件将测序结果与NCBI网站提供的人类GJB2基因标准序列(GenBank：AY280971.1；GI:33391196)进行比对。利用Omiga 2.0软件对核酸序列进行分析。

2 结 果

2.1 听力学检测结果 纯音电测听检查结果显示，先证者左右耳听力均大于71分贝，属于重度耳聋。其声阻抗检查与纯音电测听检查结果相符。颞骨CT显示内耳结构及发育均无异常。全身检查无其他系统异常，排除内耳及神经的占位病变。第二胎出生后住院期间听力筛查双耳通过，至今已10月龄，随访听力完全正常。

2.2 家系所有成员GJB2基因型测序及比对结果由图3、4可见，测序结果显示父亲携带GJB2 176-191del16杂合突变，母亲携带GJB2 235delC杂合突变。先证者分别遗传了父母有突变的一条染色体，即同时携带235delC与176-191del16的复合突变，因此属于GJB2复合突变引起的常染色体隐性遗传耳聋。因其父母均为携带者，再生育聋儿的风险为25%。胎儿遗传了母亲有突变的第13号染色体，携带GJB2 235delC杂合突变，即一条染色体为GJB2 235delC，而另一条染色体正常，因此，仅为GJB2 235delC杂合突变携带者，发生耳聋的风险与正常人群相近，不同于先证者的基因型，不会复制先证者的听力结构。

图3 先证者突变型测序图Fig.3 Sequencing results of the mutant of the proband

图4 家系各成员GJB2 DNA序列比对Fig.4 GJB2 DNA sequence alignment of the family

3 讨 论

GJB2突变所致的耳聋主要为先天性NSHI，为常染色体隐性遗传模式。在中国人群中，已检出由GJB2突变所致的儿童语前聋达到26%，占常染色体隐性遗传性耳聋的28%[9-10]。世界不同地区的耳聋家系中均检测到GJB2基因突变[11-17]，其中重度耳聋新生儿的发病率达1/800～1/1000[2,18]。近期对不同年龄段NSHI常见基因进行检测发现，GJB2基因突变患者的发病年龄集中在1岁以内，所占比例高达66.67%[19]。由于儿童NSHI无其他组织器官异常表现，因此很难及时筛查和早期干预[20]。本文家系父母均为听觉正常的GJB2突变携带者，先证者同时携带父亲的176-191del16bp和母亲的235delC突变，出生即耳聋并丧失语言能力。胎儿基因检测结果为GJB2基因235delC杂合突变，来源于其母亲，因此胎儿为GJB2 235delC杂合突变携带者，耳聋风险与正常人群接近。后随访证实，该胎儿出生后通过双耳听力筛查，至今已10月龄，听力完全正常。夫妇两人为同一基因(GJB2)致病突变携带者，这类耳聋家庭在临床中所占比例相对较小，但一旦发生，其孕育聋儿的风险将大幅提高。因此，必须注重与普及婚育前耳聋基因普遍性筛查，做好产前诊断及干预。

GJB2基因编码分子量为26.5kD的缝隙连接蛋白26(Connexin26，Cx26)，定位于染色体13q11-12，基因组DNA全长4804kb，含有2个外显子、1个内含子，其编码区位于第2外显子[21]。Cx26主要分布于内耳的血管纹、螺旋韧带、螺旋缘及耳蜗的支持细胞之间，与相邻细胞的间隙连接蛋白组成间隙连接通道，维持耳蜗中细胞间信息的正常传递和K+的正常循环，保证耳蜗听觉系统的正常功能[22-24]。GJB2基因发生突变可导致Cx26蛋白结构异常，缝隙连接缺损，通道不能正常开闭，使细胞间信号传递受阻或紊乱，从而引起感音神经性耳聋[21,25]。在我国，GJB2 235delC是NSHI患者的主要突变方式[16,26]，对先天性耳聋患者进行突变筛查发现，GJB2 235delC突变在先天性耳聋患者中所占比例为18.16%[27]。235delC突变位于Cx26蛋白第二跨膜区，引起第79位密码子移码突变，导致终止密码子提前至第82位，使所编码的多肽只有81个氨基酸，比野生型蛋白截短了145个氨基酸，造成其间隙连接功能失活，产生了一个无功能的缝隙连接蛋白[28]。176-191del16bp突变是NSHI人群GJB2基因中仅次于235delC突变的另一种突变形式[29]，可导致密码子59－76的移码改变，使终止密码子提前，产生无功能蛋白，使K+经内耳毛细胞循环回流进入耳蜗内淋巴液的循环受到影响，最终导致耳聋的发生。该家系在分子水平上验证了携带GJB2基因突变的耳聋为先天性耳聋的特点，提示在临床上进行耳聋患者GJB2基因诊断时，应将235delC和176-191del16突变列为耳聋基因检测的常规项目。

GJB2基因突变所致的耳聋大多数为隐性遗传，其系谱特点为：①患者的双亲表现型往往正常，但他们均为致病基因携带者，出生耳聋患儿的可能性约占1/4，患儿的正常同胞中有2/3的可能性为携带者；②系谱中看不到连续传递，即表现为散发病例，往往在整个系谱中只有先证者1例患者；③性状的遗传与性别无关；④近亲婚配时，后代中发病率明显增高。因此，在产前诊断中，如果发现胎儿携带2个GJB2基因的致病突变位点，则其发生耳聋的概率为100%。我们将家系的分析结果用于先证者家庭的产前筛查与产前诊断，避免了该家庭再次生育突变基因型的儿童。在我国的NSHI患者中，明确为GJB2基因突变引起耳聋的比例达到21.01%[29]。因此对GJB2基因突变导致耳聋的家庭进行遗传咨询、产前筛查和产前诊断显得尤为重要。

耳聋产前诊断应尽可能在孕早期进行，早期得到诊断结果，早期进行生育选择，避免痛苦较大的中后期引产。此外，母亲最好提前进行遗传咨询，在耳聋遗传风险以及致聋基因型确定之后再怀孕，以免造成不良后果[30]。此例家庭的胎儿只携带了来自母亲的235delC杂合突变，未导致听力异常是幸运的，但怀孕前未进行遗传咨询或检查时间较晚则不可取。接受产前诊断时，应根据母亲妊娠的不同时期选择适当的取材方法，妊娠11～13周时行绒毛膜取样，妊娠16～22周时行超声引导下羊膜腔穿刺羊水取样，妊娠22～37周时行超声引导下的脐带穿刺取血(妊娠13～16周时暂不取材)。因此笔者建议，如发现有耳聋先证者，先确定其耳聋病因；在进行了基因突变分析和详尽的遗传咨询后，再决定其家系成员是否受孕和接受产前诊断。只有这样，才能真正达到产前诊断目的，从而有效阻断耳聋在这一高危人群中的传递。

我国每年新生聋儿约3万例，耳聋的基因筛查和产前诊断依然面临艰巨的任务和挑战。随着新一代测序技术的应用，新的耳聋基因将不断被发现和鉴定，这为临床遗传性耳聋的基因诊断提供了新的候选位点，也为遗传咨询和产前诊断提供了新的依据，有助于进一步降低出生缺陷。

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