北京市药品检验所（100035）王似锦 高春

疫苗免疫仍然是当今预防流感最有效的手段。国际标准的流感疫苗证明安全有效[1]。流感疫苗是最早进行核酸疫苗研究的一种疫苗[2]。流感病毒裂解疫苗是用世界卫生组织（WHO）推荐的、并经国务院药品管理部门批准的甲型和乙型流行性感冒（简称流感）病毒株分别接种鸡胚，经培养、收获病毒、病毒活化，纯化、裂解后制成[3]。

裂解型流感灭活疫苗是建立在流感全病毒灭活疫苗的基础上，通过选择适当的裂解剂和裂解条件裂解流感病毒，去除病毒核酸和大分子蛋白，保留抗原有效成分HA和NA以及部分M蛋白和NP蛋白，经过不同的声场工艺取出裂解剂和纯化有效成风制备而成。目前使用的裂解剂主要包括乙醚、3-N-丁基磷酸盐（Tri-N-butyl phosphate）、聚山梨酯80（Polysothat 80）、脱氧胆酸钠（Sodiumdeoxyholate）及三硝基甲苯X100（TritoX100）等，裂解型流感疫苗可降低全病毒灭活疫苗的接种副反应，并保持相对较高的免疫原性，可扩大疫苗的使用范围，但在制备过程中须添加和去除裂解剂[4]。

中国药典2010年版三部附录[5]要求，只要供试品性状允许，应采用薄膜过滤法，并要求进行方法学验证。当建立产品的无菌检查法时，应进行方法的验证，以证明所采用的方法适合于该产品的无菌检查。流感病毒裂解疫苗含硫柳汞防腐剂，在无菌检查过程中，该防腐剂的残留有可能导致加入的验证菌株无法生长，从而导致无菌检查法的验证失败[6]。本研究用硫代硫酸钠作为中和剂，该中和剂能够成功的消除硫柳汞防腐剂的抑菌作用，从而建立了流感病毒裂解疫苗的无菌检查法，现将笔者的研究总结报告如下。

1 仪器与材料

1.1 仪器与设备 HTY无菌隔离器（杭州泰林生物技术设备有限公司）；HTY-2000A集菌仪（杭州泰林生物技术设备有限公司）；一次性使用的全封闭三联集菌培养器KDGB330（杭州泰林生物技术设备有限公司）；生化培养箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）。

1.2 样品 本试验所用样品为流感病毒裂解疫苗（批号：20110604，规格：0.5ml/支），由北京天坛生物制品股份有限公司生产。

1.3 试剂和培养基 0.1%蛋白胨水溶液、硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基均按照中国药典2010年版三部附录[5]ⅫA无菌检查法项下要求配制及灭菌。0.1mol/L的硫代硫酸钠溶液：取硫代硫酸钠26g与无水碳酸钠0.20g，加新沸过的冷水适量使溶解，并稀释至1000ml，摇匀，滤过，分装，灭菌，灭菌温度为121℃，灭菌时间为30min。

附表 流感病毒裂解疫苗无菌检查法验证试验结果

1.4 菌种 本试验所用菌种：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26 003]、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B）63 501]、大肠埃希菌（Escherichia coli） [CMCC（B）44 102]、生孢梭菌（Clostridium sporogenes）[CMCC（B）64 941]、白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F） 98 001]、黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F）98 003]购自中国食品药品检定研究院。

2 方法

2.1 菌液制备 按照中国药典2010年三部附录[5]ⅫA无菌检查法项下对照菌液配置，菌液浓度10～100CFU/ml。

2.2 试验方法 取样品20支，全部转移至稀释液（0.1%蛋白胨水溶液或0.1mol/L的硫代硫酸钠溶液）100ml中，作为供试液；取一次性全封闭集菌培养器（三联），先用冲洗液（0.1%无菌蛋白胨水溶液）润湿滤膜，将上述供试液全部通过3个滤器，滤干后用冲洗液冲洗，冲洗1次，每次每膜100ml。过滤后，2个滤器加入硫乙醇酸盐流体培养基各100ml，另1个滤器加改良马丁培养基100ml。分别加入6种验证菌株（10～100CFU），硫乙醇酸盐流体培养基的滤器置35℃培养，改良马丁培养基置25℃培养，观察验证菌生长情况。

3 结果与讨论

分别采用2种稀释液的无菌检查方法学验证结果见附表所示。采用0.1%蛋白胨水溶液作为稀释液，4种细菌均生长良好，而加入的白色念珠菌和黑曲霉未生长。采用0.1mol/L的硫代硫酸钠溶液作为稀释液，4种细菌和2种真菌均生长良好。细菌在使用两种稀释液的情况下均能够生长良好，分析原因可能是硫乙醇酸盐流体培养基中含有硫乙醇酸钠，该钠盐能够中和汞类防腐剂硫柳汞[7]。而白色念珠菌和黑曲霉所用的培养基是改良马丁培养基，该培养基中没有能够中和汞类防腐剂的成分，因此，需要使用0.1mol/L的硫代硫酸钠溶液作为中和剂，以便消除该疫苗样品中的硫柳汞防腐剂的抑菌作用，从而使白色念珠菌和黑曲霉在培养72h后能够生长良好。

4 结论

流感裂解灭活疫苗是在全病毒颗粒疫苗的基础上，采用适当方法将流感病毒颗粒裂解，保留其有效抗原，去除易引起副反应的成分。有研究表明，流感病毒表面的HA在流感病毒感染过程中起着重要作用，其抗体是一种保护性抗体；同时神经氨酸酶抗体具有抑制流感病毒再感染的功能，所以也具有一定的保护作用；而病毒中的类脂成分和病毒颗粒内部的蛋白不但对抗体产生显著作用，还易引起接种副反应。裂解剂的作用是裂解病毒核酸和大分子蛋白，保留其抗原的有效成分。但裂解剂浓度过高或作用时间过长均会使血凝素（HA）发生断裂，影响疫苗抗原性，因此裂解剂的选择及作用条件非常重要。

利用硫代硫酸钠作为中和剂，能够消除流感病毒裂解疫苗中所含的硫柳汞防腐剂的抑菌作用，建立该产品的无菌检查法为：取本品20支，全部转移至0.1mol/L的硫代硫酸钠溶液100ml中，经薄膜过滤法处理，用0.1%蛋白胨水溶液分次冲洗（每膜不少于100ml），以金黄色葡萄球菌为阳性对照菌，其余操作依照中国药典2010年三部附录[5]ⅫA无菌检查法进行，应符合规定。