陈天娇，朱平



工程酵母细胞高压破碎、蛋白低温保藏和去糖基化处理对7-木糖紫杉烷糖基水解酶LXYL-P1-2活性的影响

陈天娇，朱平

100050 北京，中国医学科学院北京协和医学院药物研究所天然药物活性物质与功能国家重点实验室/国家卫生和计划生育委员会天然药物生物合成重点实验室

紫杉醇主要来源于红豆杉，作为一种“重磅炸弹”式的抗肿瘤药物，自 1992 年 12 月被美国 FDA 批准上市以来，一直是销售额最大的植物抗肿瘤药。但由于紫杉醇的天然含量极低，约占含量最高的树皮部位的万分之二，加之红豆杉生长缓慢，早期从野生红豆杉中获取紫杉醇曾给红豆杉资源造成毁灭性破坏。目前主要依靠化学半合成或苗圃栽培手段制取。苗圃栽培虽然对保护野生红豆杉资源具有积极意义，但栽培红豆杉中紫杉醇含量低微的本质没有发生改变。另一方面，红豆杉中存在着大量的紫杉醇结构类似物，其中包括含量数十倍于紫杉醇的 7-木糖-10-去乙酰紫杉醇，而后者在脱除木糖基之后形成的 10-去乙酰紫杉醇仅需在 C10 位乙酰化即可产生紫杉醇[1]。如能将这类副产物转变成紫杉醇，不仅可以减少其对环境的污染，还可以“变废为宝”，大大提高红豆杉资源的利用率。脱除木糖基可用化学法或生物酶法来完成，其中后者的专一性强、环境友好。但由于天然细胞中 β-木糖苷酶的酶量普遍偏低，用筛选得到的微生物直接进行转化效率不高[2-3]，本实验室已尝试用基因工程方法解决这一问题。我们已从具有转化 7-木糖-10-去乙酰紫杉醇为 10-去乙酰紫杉醇能力的真菌香菇中克隆得到了 7-木糖紫杉烷糖基水解酶 LXYL-P1-2，该酶隶属于糖基水解酶的第 3 家族，是一种全新的和双功能的 β-木糖苷酶和 β-葡萄糖苷酶，能高效且专一性地水解包括 7-木糖-10-去乙酰紫杉醇在内的 7-木糖紫杉烷的木糖基，生成相应的 7-羟基紫杉烷。已对该酶及其重组菌开展了酶的表征、高密度发酵与生物催化等研究[4-6]。本文报告工程酵母细胞高压破碎条件、蛋白低温保藏和去糖基化处理对 LXYL-P1-2 酶活性的影响，为利用纯化的重组酶进行酶结构与功能关系等的研究提供保障。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 重组毕赤酵母 GS115-3.5K-P1-2 由本实验室构建。

1.1.2 试剂与溶液 β-木糖苷酶通用的生色底物对硝基苯基-β-D-木糖苷（p-nitropheny-β-D-xylopyranoside，PNP-Xyl）和标准牛血清蛋白（BSA）均购自美国 Sigma 公司；蛋白酶抑制剂 Cocktail Set III（无EDTA）购自美国 Merck Millipore 公司；糖苷内切酶Endo Hf 购自美国 New England BioLabs 公司；蛋白定量染色液购自美国 Bio-Rad 公司；配制以下蛋白纯化溶液：

Buffer A：2 ml 1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）、25 ml 2 mol/L KCl、2 ml 1 mol/L 咪唑、69.44 μl 14.4 mol/L β-巯基乙醇、10 ml 甘油，加蒸馏水定容至 100 ml；

Buffer B：2 ml 1 mol/L Tris-HCl（pH 8.5）、5 ml 2 mol/L KCl、69.44 μl 14.4 mol/L β-巯基乙醇、10 ml 甘油，加蒸馏水定容至 100 ml；

Buffer C：2 ml 1 mol/L Tris-HCl（pH 8.5）、5 ml 2 mol/L KCl、69.44 μl 14.4 mol/L β-巯基乙醇、10 ml 甘油，加蒸馏水定容至 80 ml；

各种浓度的咪唑洗脱液：用 Buffer C 作为溶剂对1 mol/L 咪唑进行稀释获得。

1.1.3 设备与仪器 APV-2000 型高压细胞破碎仪购自德国 SPX 公司；P300 型超微量分光光度计购自德国Implen 公司；镍亲和层析填料购自美国 GE Healthcare 公司；岛津Labsolution 分析型高效液相工作站购自日本 Shimadzu 公司；电热恒温水箱购自北京长风公司；FE 20 型 pH 计购自瑞士 Mettler 公司；Zorbax Bio Series GR-450 分离柱购自美国 Agilent 公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞破碎条件优化

1.2.1.1 菌体处理和细胞破碎 取 20 g 冷干后的 GS115-3.5K-P1-2 菌体粉末浸泡于 140 ml 的 Tris-HCl（20 mmol/L，pH 8.0）缓冲液中，并加入 700 μl 蛋白酶抑制剂，充分混匀。待系统冷却到 4 ℃后，120 MPa 压力条件下对 GS115-3.5K-P1-2 酵母细胞进行高压破碎，分别在破碎 5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 次时取样。13 500 ×离心 30 min，检测上清液的木糖苷酶活性性并对目的蛋白进行分离纯化。

1.2.1.2 酶活力测定方法 取 10 μl 蛋白上清液与 50 μl 5 mmol/L PNP-Xyl 混匀，50 ℃、pH 5.0 条件下反应 20 min 后加入 1 ml 饱和硼酸钠终止反应，405 nm 波长处检测吸光值。

1.2.1.3 镍亲和层析法初步纯化 LXYL-P1-2 蛋白 高压破碎后的上清液用 0.45 μm 滤膜过滤，每份样品约 15 ml 初始蛋白液。镍亲和层析过程以 2 ml/min 流速进行，首先用 60 ml 去离子水冲洗 20 ml 镍亲和层析柱，再用 60 ml Buffer A 平衡镍亲和层析柱，平衡后将 15 ml 蛋白样品全部上样，用 100 ml Buffer A 冲洗纯化柱，用 100 ml Buffer B 继续冲洗纯化柱。配制不同浓度的咪唑洗脱液，分别用 60、200 mmol/L 咪唑对目的蛋白进行洗脱，每个浓度洗脱 60 ml，通过活性跟踪的方法收集 60 mmol/L 咪唑浓度下的目的蛋白洗脱组分[7]，并用孔径为 30 kD 的超滤管于 4000 ×条件下进行浓缩。

1.2.1.4 制备型高效液相色谱纯化 LXYL-P1-2 蛋白 超滤浓缩后的蛋白样品用0.45 μm 的滤器过滤，备用。首先用含 0.1 mol/L 氯化钠的 0.1 mol/L 磷酸钾缓冲液（pH 8.0）作为流动相平衡 Agilent Zorbax Bio Series GF-450 分离柱，流速 1 ml/min，30 min。每次上样 500 μl 后用上述缓冲液以 0.5 ml/min 的流速冲洗柱子，220 nm 波长检测条件下收集活性峰。

1.2.1.5 测定纯化后的 LXYL-P1-2 蛋白浓度 以 Bradford法检测目的蛋白浓度。用去离子水将 BSA 配成 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/ml 浓度梯度溶液，以去离子水为空白对照。分别取 100 μl 各浓度 BSA 溶液和待测样品溶液到干净试管中，平行做两管，加 5 ml 染色液（用去离子水将母液稀释 5 倍，预先混匀，现配现用），混匀。室温放置 10 min 后，紫外可见分光光度计 595 nm 波长检测，得到 BSA 蛋白浓度的标准曲线，读出待测样品的蛋白浓度。

1.2.1.6 LXYL-P1-2 比活力测定 LXYL-P1-2 酶活力单位（U）定义为：在 50 ℃，pH 5.0，以PNP-Xyl 为底物的条件下，每分钟产生 1 nmol 对硝基苯酚所需要的酶量。按照 1.2.1.2 的方法测定酶活性。根据 Lambert-Beer 定律，吸光值= εbc[ε：摩尔消光系数，对硝基苯酚的摩尔消光系数为 17 500 L/(mol·cm)；b：比色皿宽度，为 1 cm；c：吸光物质摩尔浓度]，因此在上述总体积为 1.060 ml 的反应体系中，单位体积 LXYL-P1-2 的酶活力（U/ml）=405× 302.86。LXYL-P1-2 糖基化蛋白的分子量约为 120 kD，根据测得的蛋白质量浓度，求出单位为 U/μmol 的酶比活力。

1.2.2 LXYL-P1-2低温保藏效果检测 测定制备纯化后 LXYL-P1-2 蛋白的木糖苷酶活力，将部分蛋白溶液分别于 4、–80 ℃下保存 35、70 d，测定低温保藏后的酶活力并与保藏前的数据相比较，明确 LXYL-P1-2 蛋白低温保藏的效果。

1.2.3 去糖基化对 LXYL-P1-2 酶活力的影响 LXYL-P1-2 的去糖基处理参考文献[4]进行。取部分 1.2.2 中获得的镍亲和层析后的蛋白溶液，经 30 kD 的超滤管在 4000 ×条件下将其浓缩到 2 mg/ml，用糖苷内切酶 Endo Hf 在 37 ℃条件下对 LXYL-P1-2 进行去糖基化处理 12 h，LXYL-P1-2 去糖基反应体系：2 mg/ml 的 LXYL-P1-2 蛋白样品 400 μl，与 50 μl 10 × G5 Buffer 和 25 μl Endo Hf 混合，加水补齐总体系到 500 μl。

分别以未经上述处理的 LXYL-P1-2 和不加 Endo Hf、但同样在 37 ℃条件下孵育 12 h 的 LXYL-P1-2 作为对照。去糖基之后的 LXYL-P1-2 经质谱分析，其分子量约为 92 kD（说明仍有部分糖基残留）[4]。根据测得的蛋白质量浓度，求出单位为 U/μmol 的比活力。

2 结果

2.1 GS115-3.5K-P1-2 酵母细胞破碎研究

如图 1 所示，通过对不同破碎次数的样品上清液和纯化后的目的蛋白进行活性测定，发现菌液在破碎 10 次的情况下上清液中的单位体积酶活力达到最大值，而比活力与破碎 5 次的样品基本相似且与用试剂盒提取的纯酶比活力相当（试剂盒提取的纯酶比活力约为 4.5 × 104U/mg，相当于 5.3 × 106U/μmol）。在破碎 20、30、40 次情况下，尽管随着破碎次数的增加总蛋白释放量可能有所增加，但单位体积酶活力基本保持与破碎 10 次的一致，而比活力则一直在降低。之后，随着破碎次数的增加，单位体积酶活力和比活力均急剧下降，到破碎 80 次时酶活力所剩无几。分析原因，可能是由于随着细胞破碎次数的增加造成酶溶液所处的温度不断上升，从而导致酶变性失活增加。破碎 10 次后细胞已基本破碎完全，综合上述结果最终确定了破碎 10 次作为 APV-2000 型高压细胞破碎仪的最佳破碎条件。

单位体积酶活力（× 102 U/ml）9.0 7.5 6.0 4.5 3.0 1.5 0.06.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0.0酶比活力（× 106 U/μmol） 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 破碎次数

2.2 LXYL-P1-2 纯酶溶液长时间低温保藏效果研究

将纯化后的 LXYL-P1-2 纯酶溶液分别置于 4 ℃和–80 ℃保存。结果如图 2 所示，保存 35 d 后，在 4 ℃条件下酶活力降低了 19.7%，而在–80 ℃条件下仅下降了 4.5%；当同样的蛋白样品在–80 ℃保存天数达到 70 d 时，酶活力降低了 18.1%。说明LXYL-P1-2 纯酶溶液保存在–80 ℃时一般不宜超过 35 d，此段时间内可保持酶活力的稳定。另外，长期低温保藏 LXYL-P1-2 蛋白应选择其粉末形式。

酶比活力（× 106 U/μmol）6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0.0 初始值 4 ℃ –80 ℃ –80 ℃35 d 35 d 70 d 储存条件

2.3 去糖基化对 LXYL-P1-2 酶活力的影响

前期研究发现，去糖基的 LXYL-P1-2 蛋白是有活性的，后续的蛋白结晶研究也主要是用其去糖基的形式。然而，糖基的有无究竟对该蛋白的活性有多大影响一直缺乏实验依据。本实验在对糖基化的 LXYL-P1-2 蛋白进行37 ℃、12 h 温育（不加 Endo Hf）的同时，在相同温度和时间条件下用 Endo Hf 水解 LXYL-P1-2 以制备去糖基的 LXYL-P1-2 蛋白。实验结果如图 3 所示，糖基化的 LXYL-P1-2 蛋白经过 37 ℃、12 h 温育后活性下降了约 3.9%，而去糖基的 LXYL-P1-2 则下降 4.6%，两者相差 0.7%，说明，LXYL-P1-2 蛋白糖基化与否不会对其活性产生实质性的影响，在去糖基处理过程中该蛋白活性的轻微下降，推测是由于 37 ℃条件下极小量蛋白变性失活所致。

酶比活力（× 106 U/μmol）5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0.0 对照 37 ℃ 12 h 去糖基 处理方法

3 讨论

在提取紫杉醇的过程中，作为副产物的7-木糖-10-去乙酰紫杉醇的收率可达 0.5% 以上[8]，是紫杉醇的几十倍。LXYL-P1-2 能高效、专一性地从 7-木糖-10-去乙酰紫杉醇上脱去木糖基生成 10-去乙酰紫杉醇，因此，LXYL-P1-2 在7-木糖-10-去乙酰紫杉醇“变废为宝”的过程中能够发挥十分重要的作用，有必要对其开展深入的研究。

在对 LXYL-P1-2 进行酶学特性以及结构与功能关系的研究过程中，高纯度且保持活性的酶蛋白是开展相关研究的物质基础和前提条件。重组酵母 GS115-3.5K-P1-2 通过胞内表达及非分泌形式产生重组酶蛋白 LXYL-P1-2（注：即使通过分泌型载体如 pPIC9K 将该基因导入毕赤酵母，重组蛋白仍主要滞留在酵母细胞内），因此，细胞破碎是制备该蛋白的第一步，相比用试剂盒进行细胞破碎，高压细胞破碎仪对细胞的破碎更为彻底且收率更高[9]。本实验对细胞破碎效果的研究表明，用 APV-2000 型高压细胞破碎仪进行细胞破碎时，最适破碎次数为 10 次，此时的蛋白释放量和蛋白活性均保持在接近最高的水平。

在得到高纯度的 LXYL-P1-2 蛋白之后，适当的保藏方法可以有效保持其活性，便于开展后续的研究。通过对纯化后的 LXYL-P1-2 蛋白溶液进行低温保藏的研究发现，在 –80 ℃保存 1 个月的时间内 LXYL-P1-2 的催化活性可以基本保持不变，当保存 2 个月之后，大约有 18% 的蛋白变性失活。当然，对于更长时间的酶蛋白保藏而言，用冷干的酶蛋白粉末结合低温保藏应能确保该酶不丧失其活性。在进行 LXYL-P1-2 晶体形成及三维结构研究中，发现糖基化的 LXYL-P1-2 蛋白很难获得高分辨率的蛋白晶体，而应用去糖基的 LXYL-P1-2 蛋白则最终解决了这一难题。前期实验已证明去糖基的 LXYL-P1-2 蛋白仍具有酶活性，本实验再次证明，LXYL-P1-2 蛋白糖基的有无不影响其活性，只是在去糖基过程中 37 ℃温度条件可能会造成极小量酶蛋白的变性失活，但这对于后续的相关研究不会造成实质性的影响。

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国家自然科学基金（30770229、31270796）；“重大新药创制”国家科技重大专项（2012ZX09301002-001-005）；中央高校基本科研业务费专项资金（2012N06）

朱平，Email：zhuping@imm.ac.cn

2014-04-08

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.05.013