朱珠 张萌 王斌

免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)是经典的免疫分子，其主要行使免疫防御功能，这是过去半个多世纪免疫学最经典的理论之一。近年来，越来越多的研究表明，很多非B细胞也可以产生Ig［1-10］。2009年，Jawahar在小鼠心肌组织和HL-1小鼠心肌细胞系中检测到Ig的表达，并发现其表达水平与心肌缺血损伤有密切关系，即在血管紧张素Ⅱ灌注时，Ig重链和轻链的转录本表达下调。此外，近年来已有一些报道显示，心肌梗死时心肌细胞间质中有大量IgM沉积［11-12］，并且血液中 IgM 及 Ig轻链(包括 λ和κ轻链)的表达水平也发生改变。心肌纤维化是指心肌组织结构中胶原纤维过量积聚，胶原浓度和胶原容积分数显著增加，各型胶原比例失衡及排列紊乱，具有收缩功能的心肌细胞数量减少，心室发生重构，室壁增厚，心肌顺应性降低，心肌收缩舒张障碍［13］。目前，心肌纤维化病理损伤机制尚不完全明确。

在本研究中我们用抗小鼠IgM重链抗体及κ轻链抗体对正常小鼠及小鼠心肌纤维化模型中的心肌组织进行免疫组织化学检测，探讨Ig分子是否在心肌细胞中存在及其定位;在心肌组织纤维化时，心肌细胞Ig分子表达水平及其定位的变化，由此可提示Ig分子在正常及病理条件下存在于心肌细胞中的意义。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

雄性野生型C57BL/10小鼠12只(购自维通利华)，体质量26～33 g，8～10周龄，分成3组，每组各4只。正常组:不处理;AngⅡ组:背部皮下手术植入AngⅡ微量泵;对照组:植入微量泵泵入生理盐水。

1.2 实验试剂和仪器

兔抗鼠IgM抗体(Bioss，USA)，生物素标记的羊抗鼠IgM抗体(Vector Laboratories)，HRP标记的山羊抗兔抗体(JacksonImmunoResearch Laboratories)，兔抗鼠Igκ抗体(委托天津三箭公司生产)，DAB 显色系统(Dako Cytomation)，Alexa Fluor 800标记的链霉卵白素(LI-COR Bioscience)，AngⅡ(Sigma-Aldrich)，Alzet植入式胶囊渗透压微量泵(DURECT)。

1.3 小鼠心肌纤维化模型制备

术前1 d于超净台内取出微量泵，浸泡于生理盐水中，37℃过夜，根据实验小鼠体质量、药物灌注速率、微量泵释放速率和最大容积，计算AngⅡ和所需0.01%乙酸溶液用量。手术当天，于超净台中用1%戊巴比妥溶液按照20 mg/kg腹腔注射麻醉，小鼠肩背部皮肤备皮，75%酒精棉球消毒，剪开皮肤于皮下造囊，埋入预置微量泵，缝合［14］。假手术组小鼠泵入生理盐水，实验组小鼠泵入 AngⅡ(1500 ng·kg－1·min－1)。术后小鼠血压升高，为造模成功。

1.4 观察指标

开胸取出心脏，PBS中洗净血液，置于甲醛中。将各组小鼠的心脏组织制成5 μm厚度的石蜡切片。进行HE染色，经脱蜡水化后，苏木素染色，分色，返蓝，伊红染色，脱水，二甲苯透明，树胶封片。

免疫组织化学染色小鼠心肌石蜡切片，经脱蜡、水化、抗原修复后，加入10%的羊血清室温封闭20 min，分别加入不同一抗(兔抗鼠IgM、兔抗鼠Igκ特异性抗体)，37℃孵育1 h，并用PBS代替一抗作为对照。用PBS冲洗3次，每次5 min。每张切片滴加不同二抗，37℃孵育30 min，PBS冲洗3次后用DAB显色，苏木素复染后树胶封片。显微镜下观察。

Western Blot检测Ig分子腹腔注射水合氯醛麻醉小鼠，体外用PBS灌流除去血液后，剪下心脏，加入RIPA裂解液，匀浆，冰浴30 min，12000×g离心15 min，取上清，定量，以小鼠血清作为阳性对照，取100 μg蛋白经 10%SDS-PAGE电泳后，电转至PVDF膜上，5%牛奶封闭1 h，加入生物素标记的羊抗鼠 IgM(1∶1000 稀释)，4℃过夜，TBST 洗膜后，加入1∶10000 Alexa Fluor 800标记的链霉卵白素，室温1 h，TBST洗膜后用Odssey Imaging System检测Ig的表达。

2 结果

2.1 IgM在正常小鼠心肌组织中的定位

抗IgM染色结果显示，正常心肌的心肌细胞呈现较强的阳性染色，阳性信号主要位于心肌细胞的横纹及闰盘。同样，抗Igκ染色也显示，Igκ主要位于横纹，尤其是靠近细胞膜的一侧染色增强，并呈节段性分布(图1)。

图1 正常心肌组织中IgM的染色情况。A、B.正常心肌组织抗IgM重链抗体的染色情况;C.为心肌组织中抗κ轻链抗体的染色情况;D.二抗对照，黑色箭头所示为心肌闰盘，红色箭头所示为心肌横纹(×400)

2.2 心肌组织中IgM的表达情况

为了排除血液中Ig的污染，我们首先应用体外灌流的方法除去心脏中的血液成分。提取心肌组织蛋白后，用IgM重链抗体进行Western Blot检测。结果显示，在还原电泳条件下，可在75000左右的位置上出现特异性的阳性条带，证实心肌组织中IgM重链的存在(图2)。

图2 Western Blot检测IgM在小鼠心肌组织中的表达。血清为阳性对照。检测了3只不同小鼠(1，2，3)的心肌组织。IgM阳性条带位于相对分子量75000处，GAPDH位于34000处

2.3 心肌纤维化组织中IgM的表达情况

2.3.1 HE染色明确实验组心肌组织发生纤维化镜下观察可见，假手术组心肌排列规律，肌纤维排列紧密。而AngⅡ埋泵组心肌细胞弥漫性空泡变，心肌细胞肥大，核固缩，可见多灶性的陈旧性心肌梗死灶或瘢痕灶。说明造模成功(图3)。

图3 假手术组和心肌纤维化组HE染色情况。左图为假手术组心肌HE染色情况。右图为血管紧张素Ⅱ埋泵组心肌染色情况，可见心肌细胞空泡变，心肌细胞肥大，核固缩，心肌间质广泛纤维化(×400)

2.3.2 心肌纤维化时IgM在心肌细胞中表达水平升高 免疫组织化学染色发现，尽管实验组及对照组小鼠的心肌细胞都呈现阳性染色，但实验组正常区域的心肌细胞呈现更强的染色，而在纤维化区域组织则未见染色或呈现弱阳性染色(图4)。

图4 IgM在假手术组和心肌纤维化组小鼠心肌中的染色情况。A.假手术组心肌组织的染色情况;B.心肌纤维化组心肌组织的染色情况(未显示纤维化区域);C.纤维化区域心肌组织的染色情况(箭头所示纤维化区域，×400)

3 讨论

自从非B细胞来源Ig发现以来，越来越多的科学家在不同来源的组织中检测到Ig的表达。本研究在前期工作的基础上，第1次明确了IgM分子可以在正常小鼠和纤维化心肌组织中表达。

众所周知，B细胞表达的Ig主要以膜型及可溶型的形式存在，其中膜型的Ig通过识别特异性抗原介导B细胞的活化，而可溶型的Ig是B细胞分化为浆细胞的产物，是B细胞来源Ig的主要存在形式及效应分子，作为抗体行使体液免疫应答。非B细胞来源的Ig也可呈现膜型及可溶型的形式，但众多的研究表明，其主要定位于细胞质［15-16］。尽管到目前为止，非B细胞来源Ig的功能还不完全清楚，但越来越多的证据表明，其主要涉及细胞的增殖、迁移及生存，甚至肿瘤的发生［17］，而不是抗体功能。提示非B细胞来源Ig是不同于经典的、新发现的另一类Ig分子。

心肌纤维化是由于成纤维细胞大量增殖，以胶原蛋白为主的多种细胞外基质沉积在心肌细胞间质，导致心肌组织重构进而造成心脏舒缩功能障碍的病症。在本研究中，我们用外源给予AngⅡ的策略制备了小鼠心肌纤维化模型，并进一步探讨了Ig分子在心肌组织发生纤维化后其表达水平及细胞定位的变化。我们的研究结果发现，在病变心肌组织，特别是在横纹呈现更强的IgM及Igκ染色。提示心肌纤维化促进了心肌细胞表达IgM，但IgM的表达是否参与心肌纤维化的发病有待于进一步探讨。

至于为何心肌纤维化时心肌细胞高水平表达IgM分子，我们有两种猜测:其一，由心肌持续的缺血缺氧所诱导［12］;其二，由成纤维细胞诱导。因为成纤维细胞对心肌细胞的生长及生存具有明显的促进作用［18］，而在心肌纤维化时，成纤维细胞能分泌一些细胞因子如TGF-β等［19］，可能通过旁分泌等机制促进了心肌细胞表达IgM分子。

综上所述，本研究第1次发现了IgM在心肌细胞中的定位;在心肌组织发生纤维化时，IgM表达水平会明显升高，但该IgM分子是否参与心肌纤维化亟待探讨。

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