陆胜利 祁超

摘要 [目的] 测定海洋放线菌S.areniocola CNS-205腺苷化结构域基因sare0357的酶活。[方法] 选取海洋放线菌Salinispora arenicola CNS-205 NRPS A domain基因sare0357，对其进行克隆表达和功能鉴定。[结果] 在以Trp为底物时测定Sare0357蛋白的酶动力学参数为：Km=（0.040 33±0.003 67）mmol/L，Vmax =（2.135 05±0.029 43）μmol/（min·L），kcat =（14.233 6±0.196 2）min;Phe为底物时：Km=（0.027 65±0.001 51）mmol/L，Vmax =（1.558 06±0.009 7）μmol/（min·L），kcat=（10.387 1 ±0.064 6）min。[结论]丰富洋放线菌Salinispora arenicola CNS-205 NRPS腺苷化结构域的底物特异性和密码子领域的研究，为组合生物学和体外酶系合成NRPs提供依据。

关键词 海洋放线菌;非核糖体多肽合成酶;腺苷化结构域;底物特异性;sare0357

中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）33-11632-04

Determination of Enzyme Activity of sare0357， a Gene of Adenylation Domain from Marine Actinomycete S.arenicola CNS-205

LU Sheng-li1， QI Chao2*

（1. Medical department， Anqing Medical College， Anqing， Anhui 246052;

2. Hubei Key Laboratory of Genetic Regulation and Integrative Biology， College of Life Sciences，Huazhong Normal University， Wuhan，Hubei 430079）

Abstract [Objective] The aim was to determine enzyme activity of sare0357， a gene of adenylation domain from marine actinomycete S.arenicola CNS-205. [Method] Marine actinomycetes Salinispora arenicola CNS - 205 NRPS A domain gene sare0357 was selected， and the cloning expression and function identification were done. [Result] It was found that Sare0357 could recognize specifically and activate tryptophan （Try） and phenylalanine （Phe）. The basic kinetic parameters of it for these two substrates were detected as Km = （0.040 33±0.003 67） and （0.027 65 ±0.001 51）mmol/L， Vmax = （2.135 05±0.029 43） and （1.558 06 ±0.009 7）μmol/min and kcat =（14.233 6±0.196 2） and （10.387 1 ±0.064 6） min for Try and Phe respectively. [Conclusion] The aim riched ocean actinomycetes Salinispora arenicola CNS-205 NRPS of adenosine structure domain research in the field of the substrate specificity and codes， and provided the basis for combination of biology and enzyme system in vitro synthetic NRPS .

Key words Marine actinomycete; Nonribosomal peptide synthetases;Adenylation domain

基金项目 国家自然科学基金项目（20772040）;教育部中央高校自主项目（CCNU14F01006）。

作者简介 陆胜利（1966-），男，安徽安庆人，讲师，从事无机与分析化学研究。*通讯作者。

收稿日期 2014-10-15

海洋放线菌能通过非核糖体多肽合成酶（NRPSs）合成一系列的具有药用价值的生物活性物质——非核糖体多肽（NRPs）。非核糖体多肽合成酶（NRPSs）由一系列的模块构成，其中的氨基酸腺苷化结构域（A domain）能特异性识别和激活氨基酸底物，在非核糖體多肽合成中起着关键性作用。

海洋放线菌Salinispora arenicola CNS-205基因组测序结果表明， 在5 786 361 bp 的环状染色体中分布有10个NPRS相关基因簇，sare0357基因属于10个基因簇中的SA nrps1 （sare0345-0367）[1-2]。sare0357基因在NCBI上被假定为NRPS腺苷化结构域基因。笔者选取海洋放线菌Salinispora arenicola CNS-205 NRPS A domain基因sare0357，对其进行克隆表达和功能鉴定，能丰富洋放线菌Salinispora arenicola CNS-205 NRPS腺苷化结构域的底物特异性和密码子领域的研究，同时也可为组合生物学和体外酶系合成NRPs提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器

1.1.1

菌株、质粒。

稀有海洋放线菌Salinispora arenlocola CNS205试验菌株为华中师范大学结构生物学实验室保存。

表达载体（pET28-a、pGEX-KG）、表达质粒和感受态细菌（E.coli DH5α、E.coli BL21）为安庆医药高等专科学院实验室保存。……