吕 波，贾桂颖

(天津大学药物科学与技术学院，天津 300072)

药物经给药部位吸收入血，在人体内通过与蛋白迅速可逆的结合，从而影响到药物作用的产生、发展和消除。研究药物与蛋白结合机理、结合常数、部位、作用力等不仅对药物代谢动力学，临床用药有一定意义，且对药物分子设计、新药研发也有重要指导意义。药物蛋白结合常数(Ka)是评价药物性质的重要参数，简单快速的测定Ka值，对于药物蛋白相互作用研究，药物评价与筛选具有重要意义。

Ka常见的测定方法有平衡透析法［1］、荧光光谱法［2］、亲和色谱法［3］、核磁共振分析法［4］等。这些方法都存在一定缺陷，如透析法测定周期长，且往往是单点测量，测量误差大;荧光法中蛋白不可重复利用，不利于一些昂贵的蛋白研究;亲和色谱法需要制备特殊的键合蛋白的色谱填料并进行装柱;核磁共振分析法虽获得信息量大，但是测定周期长，仪器昂贵，且不利于定量分析，对蛋白纯度要求也极高。磁性微球曾被用于药物蛋白结合常数测定［5-6］，最近王秋玲等［7］将磁性微球应用于凝血酶蛋白-抑制剂解离常数的快速测定，但磁性材料其特殊性质(如含有Fe3+)容易造成非特异性吸附高、蛋白失活、测量误差大等结果。

瑞替加滨是首个开发的钾离子通道开放剂，用于成人癫痫部分发作的辅助治疗，在血药浓度0.1～2μg/mL范围内，本品约80%与血浆蛋白结合［8］，但是其结合常数还未见报道。本文以非磁性微球为载体，以BSA为蛋白模型，通过筛选微球、优化蛋白偶联方法，降低了微球对药物的非特异性吸附，通过一步步探究将可能引起误差原因降至最低。最终采用一种氨基化微球用于Retigabine与BSA的结合常数测定，并与传统荧光光谱法测定结果进行对比。新方法测定准确、精密度高、方法简易、成本低、且蛋白可重复利用，对研究药物蛋白相互作用提供了新方法、新思路。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

瑞替加滨原料药(纯度 ＞99.5%)，自制;牛血清白蛋白，生物级;BCA蛋白浓度测定试剂盒;无定形氨基硅胶(氨基279.16 μmol/g，40 ～60 μm);球形氨基硅胶(氨基303.28 μmol/g，5 μm);氨基聚苯乙烯微球(氨基102.36 μmol/g，5 μm);羧基聚苯乙烯微球(羧基 256.96 μmol/g，5 μm);1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC，纯度97%);N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，纯度98%);戊二醛、氰基硼氢化钠、甲醇均为分析纯。

Waters高效液相色谱仪(包括Waters 510高压输液泵，Waters 486紫外检测器和N2000在线色谱工作站);C18色谱柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);970CRT荧光分光光度计;SHZ-82恒温振荡器。

1.2 牛血清白蛋白偶联微球的制备

1.2.1 EDC/NHS法 取50 mg氨基微球均匀分散于1 mL PBS缓冲液中。加入9 mg BSA，涡旋分散均匀，加入12.5 mg NHS，缓慢振摇后加入25 mg EDC，室温振荡反应2 h，用缓冲液充分洗涤，即得。

1.2.2 戊二醛交联法 取50 mg氨基微球均匀分散于 1 mL PBS 缓冲液(0.01 mol/L，pH 7.4)中，加入3 mL戊二醛水溶液(0.529 mol/L)，27℃活化反应2 h。用PBS离心洗涤3次，加入2 mL BSA溶液(10 mg/mL)，37℃恒温振荡反应19 h。加入50 mg氰基硼氢化钠继续反应4 h。用缓冲液充分洗涤，得蛋白偶联微球。

1.3 蛋白偶联微球应用于瑞替加滨与BSA结合研究

1 mL的EP管中加入300μL瑞替加滨溶液(0.75μmol/L)，设置自由组、空白组和实验组，对应的再分别加入500μL的PBS缓冲液、空白微球PBS溶液(12.5 mg/mL)、键合蛋白微球PBS溶液(12.5 mg/mL)，混合均匀后37℃恒温振荡15 min，经离心分离，用高效液相色谱法分别测定三组上清液中瑞替加滨药物浓度。改变药物浓度，重新测定，最后相应数值代入Rosenthal方程［9］，计算得到瑞替加滨与BSA的结合常数。

1.4 分析方法

1.4.1 微球键合蛋白量测定 采用BCA蛋白浓度测定法。取20μL球液(50 mg/mL)与200μL工作液混合，60℃孵育30 min，13 000 r/min离心3 min。取100μL上清液，用酶标仪测定562 nm波长条件下吸光度值。同法在0～45.45 mg/L浓度范围内建立BSA标准浓度曲线。对比标准曲线计算得微球键合蛋白量。

1.4.2 高效液相色谱法测定上清液中瑞替加滨药物浓度条件 流动相甲醇∶磷酸缓冲液(0.03%，v/v，pH 2.6)，比例为 70∶30(v/v)，流速 0.7 mL/min，紫外检测波长252 nm，进样体积20μL。

1.4.3 荧光分光光度法测定瑞替加滨与BSA结合常数 激发波长为285 nm，在200～800 nm范围内扫描发射波长，灵敏度4，入射狭缝 10 nm，出射狭缝10 nm。

5 mL荧光比色皿中加入2.5 mL BSA溶液(1.0×10－5moL/L)，连续扫描3次，加入10μL瑞替加滨溶液(1.48μmoL/L)，反复吹打混合均匀后，连续扫描3次。再次重复加入药物溶液，重复上述步骤。加入药液总量不超过100μL，记录保存图谱，取374 nm波长条件下荧光强度作为计算值代入Stern-Volmer方程［10］，计算得瑞替加滨与BSA的结合常数。

2 结果与讨论

2.1 不同粒子对瑞替加滨的非特异性吸附研究

空白微球会与瑞替加滨产生非特异性吸附，为了尽可能的降低非特异性吸附，减少误差，对几种常见的非磁性粒子——无定形氨基硅胶、球形氨基硅胶(SiO2-NH2)、氨基聚苯乙烯微球(PS-NH2)、羧基聚苯乙烯微球(PS-COOH)的非特异性吸附进行考察，结果见图1。

图1 不同粒子对瑞替加滨的非特异性吸附研究Fig.1 The study of nonspecific adsorption for different particles to Retigabine

由图1可知，在同一药物初始浓度(5μmol/L)下，加入相同量(6.25 mg)的空白粒子，4种粒子的非特异性吸附分别占药物初始浓度的0.33%，3.96%，8.26%，27.57%。无定形氨基硅胶对瑞替加滨几乎没有吸附，这与其表面亲水，孔径较大有关，但是无定形硅胶与蛋白键合量很低，亲水性强，后续离心操作中很容易丢失，不宜作为蛋白载体。SiO2-NH2与PS-NH2吸附量接近，PS-NH2吸附量更高，这主要是因其表面亲脂。经二步溶胀的羧基化聚苯乙烯微球空白吸附量最高，原因一是其表面亲脂，二是表面为疏松多孔结构，三在pH 7.4的PBS缓冲液条件下，其表面羧基官能团(pKa4.74)易与碱性药物瑞替加滨(pKa10.8)静电结合。综上初步确定球形氨基硅球(SiO2-NH2)与氨基化聚苯乙烯微球(PS-NH2)为测定结合常数所用微球。

2.2 EDC/NHS法与戊二醛交联法对蛋白键合量影响

考察了EDC/NHS法中蛋白浓度对蛋白偶联量的影响，结果见图2。

图2 EDC/NHS法中BSA浓度对蛋白键合量影响Fig.2 Effect of BSA concentration on the protein binding content for EDC/NHSmethod

由图2可知，随BSA浓度增加，蛋白键合量出现先增加后降低的趋势，PS-NH2(表面氨基量102.36 μmoL/g)最高键合量为 2.88 mg/g。初始键合量增加，是因为EDC/NHS相对过量，BSA中羧基官能团与微球上的氨基键合。蛋白浓度进一步升高，EDC/NHS不足以使过量的蛋白键合到微球表面，相反会引起BSA蛋白间的相互反应，所以键合量下降。经计算该方法的蛋白利用率仅为1.6%，表面氨基利用率为0.42‰。

戊二醛法中戊二醛浓度与蛋白浓度对蛋白偶联量影响结果见图3和图4。

由图3(蛋白浓度2 g/L)可知，随戊二醛浓度增大，蛋白键合量增加，且低浓度范围内，键合量增加显著。戊二醛浓度为0.529 moL/L(与微球表面氨基反应比例为4.1∶10)时，蛋白键合量最高。继续增大戊二醛浓度，容易使蛋白失活，且戊二醛分子两端醛基会同时与微球表面氨基反应，无法起到桥接作用，不利于蛋白键合。

图3 戊二醛浓度对蛋白键合量影响Fig.3 Effect of glutaraldehyde concentration on the protein binding content

图4 BSA浓度对蛋白键合量影响Fig.4 Effect of BSA concentration on the protein binding content

由图4(戊二醛浓度0.529 moL/L)可知，蛋白浓度在0.3～25 g/L范围内变动，蛋白键合量增势逐渐趋于平缓。这是因为戊二醛活化氨基数量有限，过高浓度蛋白也无法键合到微球表面。BSA浓度为10 g/L时，PS-NH2蛋白键合量为12.44 mg/g，SiO2-NH2可达 39.86 mg/g，均比 EDC/NHS 法高出数倍，因此，选用戊二醛法作为蛋白偶联方法。SiO2-NH2微球有最高的蛋白键合量，确定选用SiO2-NH2微球为载体。

2.3 药物蛋白相互作用结合时间考察

在瑞替加滨浓度为5μmoL/L条件下，加入6.25 mg SiO2-NH2-BSA 微球，测定2～30 min条件下药物吸附量，结果见图5。

由图5可知，起始阶段，瑞替加滨与蛋白结合急剧增加，从2 min开始，吸附逐渐变缓，后达到饱和，10 min时吸附量已不再增加。为使瑞替加滨与蛋白充分结合，同时考虑到测量时间与药物稳定性，将结合时间定为15 min。

图5 结合时间对药物吸附量影响Fig.5 Effect of bonding time on the quantity of drug adsorption

2.4 药物浓度对结合常数的影响

键合蛋白微球用量6.25 mg，测定吸附前后上清药物浓度变化，绘制等温吸附曲线，见图6。

由图6可知，瑞替加滨吸附量随药物浓度增大而增大，低浓度范围内增大较快，后逐渐平缓，达到饱和吸附。选取测量浓度应注意，一药物浓度不宜过高，否则药物相对蛋白过量，易造成吸附不完全，引起误差。二药物浓度不宜过低，否则达到紫外检测器极限，引起偶然误差。三为模拟人体环境，药物浓度应尽量与血药浓度接近，即在微摩尔每升浓度范围内。最终确定选取1.25～15μmol/L浓度范围为测定范围。

2.5 结合常数测定

在1.25～15μmol/L范围内改变瑞替加滨药物浓度，通过HPLC-UV方法测定上清浓度变化，结果见图7(药物初始浓度为7.5μmol/L)，将相应数值代入Rosenthal方程:

式中 ［Db］——药物与蛋白净结合浓度，mol/L;

［D'］——药物与微球非特异性吸附浓度，mol/L;

Bmax——固定化蛋白活性结合位点数，mol/L;

Kd——药物与蛋白解吸附平衡常数，mol/L。

［Db］由［Dtotal］－［D'］得到，［Dtotal］是药物与键合蛋白微球结合总量。以［Db］/［D'］为纵轴，［Db］为横轴，绘图见图8，拟合线性方程 y=－2.09×104x+0.200 1，斜率即为瑞替加滨与牛血清白蛋白的结合常数 Ka=2.09×104L/mol。将微球用 PBS洗净干燥后连续测定3次，计算 Ka为(2.09±0.025)×104L/mol。

图7 吸附前后上清瑞替加滨液相色谱图Fig.7 Chromatogram of Retigabine of supernatant before and after adsorption

图8 瑞替加滨药物的Rosenthal曲线Fig.8 Rosenthal plots of Retigabine

2.6 荧光光谱法测定结合常数

以285 nm波长为激发光，荧光滴定结果见图9。

由图9可知，在374，695 nm处有两个最大发射峰。随着滴加药物浓度增加(箭头方向)，两个波长处的荧光发射强度逐渐降低，且两峰均出现蓝移。BSA荧光发射峰与其色氨酸残基内环境有关，蓝移说明BSA腔内疏水环境的极性减弱，疏水性增强，肽链收缩。

以374 nm波长处荧光强度及对应药物浓度代入Stern-Volmer方程:

式中，F0为蛋白的初始荧光强度，F为药物浓度为［Q］时的荧光强度，［Q］为药物浓度，K为淬灭常数即药物蛋白结合常数。

拟合线性方程后得 K310.15=1.607 ×104L/mol，与SiO2-NH2微球测定结果一致。蛋白键合到微球表面有一定失活，而且荧光滴定法采用的公式不同，Ka计算值也不同，这可能是造成结果微小差别的原因。

图9 37℃下瑞替加滨与BSA结合的荧光光谱图Fig.9 Fluorescence spectra of Retigabine and BSA at 37℃

3 结论

以新型抗癫痫药物瑞替加滨与牛血清白蛋白为模板，氨基化粒子为蛋白固定载体，用高效液相色谱紫外检测法，测定了瑞替加滨与BSA的结合常数，并与传统荧光滴定方法对比，两者结果一致。微球经洗涤后仍可重复使用，且不影响测量精密度。新方法实用、便捷、经济，可用于药物蛋白结合常数的测定，为研究药物小分子与蛋白大分子相互作用提供了新方法新思路。

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