薛 瑞，张青松，张玉洁，曹军华

0 引言

乳腺癌是全球第二高发的恶性肿瘤，特别是在欧美国家，为女性中发病率最高的癌症。近年来我国乳腺癌的发病率也逐年增高，目前临床上主要以手术和化疗为治疗手段［1］。化疗在乳腺癌治疗中占有重要的地位，但其缺乏选择性，损伤机体，影响机体的免疫功能。华蟾素注射液主要成分是蟾毒灵和吲哚生物碱等，为干蟾皮的水化萃取物，对多种人肿瘤细胞都具有抑制作用，因安全有效、毒副作用小而被广泛应用于临床［2］，但其作用机制尚不明确。本研究观察华蟾素体内对MCF-7荷瘤裸鼠肿瘤生长及免疫功能的影响，探讨其抗乳腺癌作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料 人乳腺癌MCF-7细胞由华中科技大学同济医学院提供;SPF级BALB/C-nu裸鼠，体重16～20 g，购于中国医学科学院上海实验动物繁殖中心，按SPF级要求管理;华蟾素注射液(安徽金蟾生化股份有限公司);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料公司);RPMI 1640培养粉(Gibco公司);顺铂(江苏豪森药业股份有限公司);MTT和胰蛋白酶(Sigma公司);ELx800型酶联免疫检测仪(BIO-TEK公司);CO2孵箱(JOUAN公司);FACS Calibur型流式细胞仪(美国 BD公司产品);其他试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 裸鼠荷瘤模型的建立及分组 裸鼠饲养在26～28℃、40% ～60%的湿度环境中，全部实验饲养过程达到SPF条件。MCF-7细胞置于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，在37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养。取对数生长期细胞，调整浓度至1×107/mL，于裸鼠右前肢腋背部皮下接种0.2 mL。接种成功的裸鼠随机分为5组:模型组、顺铂(25 mg/kg)阳性对照组、华蟾素(25、50、100 mg/kg)3个剂量组，每组10只。另设正常对照组。正常组和模型组每日用生理盐水灌胃，顺铂和华蟾素组采用腹腔注射方式给药，每次0.2 mL，皆连续给药12 d。

1.2.2 血常规及肝、肾功能的检测 末次给药后24 h，对裸鼠称重，每只腹腔注射0.5%肝素0.5 mL，使肝素化后摘除眼球取血，一部分肝素抗凝全血检测血常规中白细胞(leukocyte，Leu)、血红蛋白(haemoglobin，Hb)和血小板(platalet，Plt)的浓度;一部分离心分离出血浆检测肝功能中丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)、γ-谷氨酰转移酶(γ-glutamyltransferase，γ-GT)和肾功能中血尿素氮(Blood urea nitrogen，BUN)、肌酐(creatinine，Cr)的浓度。

1.2.3 外周血T淋巴细胞亚群的检测 裸鼠血清用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，加入荧光标记抗CD4+和CD8+抗体，4℃避光反应30 min，用PBS洗涤2次，1%的多聚甲醛400 μL固定，流式细胞仪检测CD4+和CD8+细胞数。

1.2.4 抑瘤率的检测 取血后断髓处死裸鼠，剥瘤，称重。计算抑瘤率:抑瘤率(%)=(1-给药组平均瘤重/阴性对照组平均瘤重)×100%。

1.2.5 脏器指数和脾淋巴细胞增殖的检测 剥瘤的同时取胸腺、脾脏，称重，计算胸腺、脾脏指数。取脾脏并制成细胞悬液。用DMEM培养液调整细胞浓度至5×106/mL。在37℃、5 CO2条件下刀豆蛋白(5 μg/mL)作用72 h。培养结束后，离心，弃上清，每孔加入异丙醇200 μL，室温振荡，在酶标仪上550 nm处检测A值。

1.2.6 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件进行分析，计量资料以±s来表示，配对组间比较采用样本t检验，多组间比较采用方差分析。

2 结果

2.1 对荷瘤裸鼠血常规、肝肾功能的影响 给药12 d后，顺铂组荷瘤裸鼠的白细胞数为(8.14±1.30)×109/L，与模型组(12.52±2.15)×109/L相比明显降低(P＜0.01);而华蟾素3个给药组血常规、肝肾功能的检测结果与模型组比较差异均无统计学意义(P＞0.05)，具体结果见表1。

表1 荷瘤裸鼠的血常规、肝肾功能和体重检测结果(±s，n=10)

表1 荷瘤裸鼠的血常规、肝肾功能和体重检测结果(±s，n=10)

注:与阴性对照组比较，*P＜0.01

组别 白细胞(×109/L)血红蛋白(g/L)血小板(×109/L)丙氨酸氨基转移酶(U/L)γ-谷氨酰转移酶(U/L)血尿素氮(mmol/L)肌酐(μmol/L)模型组 12.52±2.15 114.76±4.87 1 109.4±120.1 61.29±6.30 50.2±2.71 7.43±2.41 67.04±9.26顺铂组 8.14±1.30* 108.15±11.41 1 053.2±98.5 63.02±7.41 57.7±6.25 7.24±0.49 63.14±8.03华蟾素(25 mg/kg) 10.47±1.49 119.66±8.16 1 069.3±126.4 59.13±7.25 54.2±7.85 6.78±1.03 59.23±5.35华蟾素(50 mg/kg) 11.13±2.01 121.17±6.15 1 063.5±121.2 65.34±8.01 59.2±4.83 6.04±1.42 62.16±8.07华蟾素(100 mg/kg) 11.59±2.21 118.46±4.36 1 074.4±119.7 60.32±7.41 50.3±5.63 7.14±2.03 63.12±9.95

2.2 对荷瘤小鼠T细胞亚群的影响 流式细胞仪检测发现，华蟾素能够改善荷瘤裸鼠CD4+和CD8+细胞数目的异常，提高 CD4+/CD8+比值。其中高剂量组与荷瘤对照组比较差异有统计学意义(P ＜0.05)，见表2。

2.3 对荷瘤裸鼠移植瘤生长抑制作用 与模型组比较，顺铂(25 mg/kg)和华蟾素3个剂量(25、50、100 mg/kg)腹腔注射给药皆可明显抑制荷瘤裸鼠的瘤质量，差异有统计学意义(P＜0.001);随着华蟾素剂量的增加，抑瘤率增高，见表3。

2.4 对裸鼠脏器指数和淋巴细胞增殖的影响华蟾素对荷瘤裸鼠的脾脏增大没有拮抗作用，而对胸腺增大有抑制作用，高剂量与模型组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。模型组裸鼠T淋巴细胞的增殖能力显著下降，华蟾素能够剂量依赖性地促进其增殖，高剂量组与模型组比较，差异有统计学意义(P＜0.01)，见表4。

表2 华蟾素对荷瘤裸鼠T细胞亚群的影响(±s，n=10)

表2 华蟾素对荷瘤裸鼠T细胞亚群的影响(±s，n=10)

注:与正常对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01;与模型组比较，*P＜0.05

组别 剂量(mg/kg)CD4+/CD3+(%)CD8+/CD3+(%)CD4+/CD8+(%)正常组- 75.09±2.56 19.61±2.54 3.86±0.36模型组 - 63.47±2.65## 27.54±3.33# 2.31±0.28##顺铂组 25 68.41±2.85 24.96±2.18 2.74±0.60华蟾素 25 68.66±4.78 25.07±2.68 2.73±0.45华蟾素 50 68.90±4.18 24.77±2.12 2.78±0.29华蟾素 100 70.37±2.97* 21.38±3.34 3.30±0.31*

表3 华蟾素对荷瘤裸鼠瘤质量的影响(±s，n=10)

表3 华蟾素对荷瘤裸鼠瘤质量的影响(±s，n=10)

注:与模型组比较，*P＜0.001

组别 剂量(mg/kg) 瘤质量(g) 抑瘤率(%)模型组-1.878±0.513 -顺铂组 25 0.923±0.042* 50.86华蟾素 25 1.214±0.100* 35.39华蟾素 50 1.082±0.206* 42.40华蟾素 100 0.978±0.113*47.95

表4 华蟾素对荷瘤裸鼠免疫指标的影响(±s，n=10)

表4 华蟾素对荷瘤裸鼠免疫指标的影响(±s，n=10)

注:与正常对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01;与模型组比较，*P＜0.05，＊＊P＜0.01

组别 剂量(mg/kg)脾脏指数 胸腺指数 淋转刺激指数- 5.33±0.18 5.55±0.20 3.12±0.13模型组 - 7.62±0.73##7.04±0.75#2.03±0.27##顺铂组 25 7.76±0.18 6.16±1.44 2.11±0.41华蟾素 25 6.78±0.14 5.32±1.3 2.05±0.32华蟾素 50 7.04±0.16 4.76±1.86 2.37±0.42华蟾素 100 7.11±0.19 4.04±1.02*2.83±0.23正常组＊＊

3 讨论

华蟾素注射液是大蟾蜍皮经加工制成的水溶性制剂，具有清热解毒、利水消肿、化癖溃坚等作用，现在临床上用于多种恶性肿瘤的治疗［3-5］。本研究发现，3个剂量的华蟾素均可抑制乳腺癌模型裸鼠肿瘤的生长，提示其体内具有抗乳腺癌活性。而通常药物浓度超过一定范围会有毒副作用，一般表现在对消化系统、造血系统及肝肾功能的影响上。本研究观察给药期间裸鼠的一般状况，华蟾素给药的三组裸鼠均未见有消瘦、厌食、活跃程度下降等异常;血常规及肝肾功能检测结果和模型组比较也均无显著差异(P＞0.05)，提示在本给药剂量下，华蟾素可选择性抑制MCF-7细胞的生长，而对正常血细胞和肝、肾器官无明显毒副作用。相比之下，顺铂组荷瘤裸鼠的白细胞数明显低于阴性对照组(P＜0.05)，可能与顺铂有一定的骨髓抑制性有关。

恶性肿瘤的发生、发展与机体免疫功能紊乱密切相关。免疫功能较低者，恶性肿瘤发生率增高;而肿瘤进行性生长时又会导致机体免疫功能进一步受损［6-7］。T淋巴细胞浸润程度可反映机体的抗肿瘤状态。成熟T细胞按细胞膜分子表型不同，可分为CD4+T细胞和CD8+T细胞，二者细胞膜上均有CD3抗原，对免疫功能的影响相反。T淋巴细胞介导的细胞免疫功能低下时，调节免疫反应活性的CD4+细胞比例减少，具有免疫抑制功能和细胞毒作用的CD8+细胞比例增多［8-9］。本结果显示，模型组小鼠T淋巴细胞的增殖显著下降，华蟾素能够剂量依赖性地促进其增殖，并提高荷瘤裸鼠CD4+/CD8+比值，高剂量组效果更为显著，提示其可通过促进T淋巴细胞增殖及调节T淋巴细胞亚群而改善细胞免疫功能状态。

调节机体的免疫功能是肿瘤综合治疗的重要环节，也是评价肿瘤辅助治疗的重要指标。华蟾素既有一定的抑瘤作用，又可提高荷瘤裸鼠的免疫功能，还有其他的抗肿瘤作用机制，有待进一步研究。

［1］水若鸿，杨文涛，龚西騟.腔面型乳腺癌的临床病理特征和研究进展［J］.临床与实验病理学杂志，2013，29(3):235-239.

［2］冯坤，周怀君，胡娅莉，等.华蟾素对子宫内膜癌Ishikawa细胞株裸鼠皮下移植瘤生长及RRM2基因表达的影响［J］.中国中西医结合杂志，2010，30(11):1183-1185.

［3］刘琳，陈宝安，秦叔逵，等.三氧化二砷联合华蟾素抗裸鼠人肝癌移植瘤血管新生的作用［J］.中国中西医结合杂志，2011，31(1):67-72.

［4］沈玲，朱海超，杨雪，等.华蟾素联合放疗对胃癌细胞BGC-823增殖及凋亡的影响［J］.实用医学杂志，2012，28(11):1762-1764.

［5］邹海萍，郭显智，朱玉芬.华蟾素联合化疗EOF方案治疗晚期胃癌临床研究［J］.中国临床医学，2012，19(2):140-141.

［6］韩英，徐文清，杨福军，等.银耳多糖的抗肿瘤作用及其机制［J］.医药导报，2011，30(7):849-852.

［7］Hadden JW.Immunodeficiency and cancer:prospects for correction［J］.Int Immunopharmacol，2003，3(8):1061-1071.

［8］芦兰，艾立清，师幸伟，等.自体CIK细胞对晚期结肠癌患者免疫功能的影响［J］.医学综述，2013，19(6):1136-1138.

［9］袁丽萍，张曙萱，杨晓明，等.妊娠梅毒患者外周血T淋巴细胞亚群的检测及临床意义［J］.齐齐哈尔医学院学报，2013，34(3):323-324.