祁永清 李菊英 贺菊香 张梦岚

高原缺氧的恶劣环境，导致机体发生一系列机能和形态的变化，胃肠道对缺氧较为敏感，可引起胃黏膜出血、胃溃疡等消化系统疾病。在高原低氧地区胃黏膜出血、胃溃疡、慢性萎缩性胃炎比平原地区高发。胃癌是高原地区常见的恶性肿瘤之一，发病趋于年轻化，而且大部分患者来就诊时就已进入了中晚期，失去了最佳的治疗机会，是一种严重威胁高原地区人民生命健康的主要疾病。胃癌的发生是多因素参与的多阶段、多步骤过程，导致细胞过度增生、异常分化、细胞凋亡减少而形成的。选择特异性性抗体，对胃癌早期诊断及胃癌细胞生物学的影响和胃癌患者的预后评估有着重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料 收集2010年7月至2011年5月青海大学附属医院及青海省人民医院送检病理科的胃癌切除标本60例，男38例，女22例;年龄35～80岁，平均55.7岁;高分化10例，中分化21例，低分化29例;淋巴转移33例，无转移27例。取正常体检并本人自愿情况下的正常胃黏膜2～4块，共10例。年龄28～74岁，平均年龄(47±8)岁。上述标本，留取部分-80℃保存以备提取RNA，部分经10%中性甲醛固定48 h，常规脱水、透明和包埋，连续切片，厚度为4μm，HE常规染色诊断，符合实验要求的组织蜡片置于预先涂有多聚赖氨酸的载玻片烤干备用。

1.2 试剂 THBS4一抗为兔抗人多克隆抗体，购自美国GENETEX公司。即用型第二抗体A、B液、柠檬酸抗原修复液、PBS工作液、浓缩型DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术公司。RT-PCR试剂:Trizol试剂(购自北京赛百盛公司)、RT-PCR试剂盒(购自美国Promega公司)、100bpDNA marker(购自上海生物工程公司)、PCR引物(购自上海生物工程公司)、琼脂糖(购自上海GeneTech公司)、Tfis碱(购自美国Sigma公司)。

1.3 方法

1.3.1 免疫组化S-P法检测THBS4蛋白的表达:石蜡切片(4μm)、37℃烤片过夜、二甲苯Ⅰ30 min，二甲苯Ⅱ脱蜡30 min、100%、95%、90%、85%、80%乙醇依次水化5 min、PBS洗3次×5 min、柠檬酸高压抗原间接修复10 min、自来水中放置高压锅降温，降至高压锅微温时取出组织切片、滴加一抗(THBS4抗体稀释度为1∶75、湿盒放置37℃温箱2 h、PBS洗3次 ×5 min、滴加二抗(抗鼠/兔)，增强剂，湿盒放置37℃温箱30 min、PBS洗3次×5 min、滴加二抗(抗鼠/兔)，稳定剂，湿盒放置37℃温箱30 min、鲜配制DAB显色，镜下控制5～10 min、PBS漂洗，终止显色、苏木素复染45 s，1%盐酸酒精分色，温水冲洗反蓝、75%、95%、100%乙醇脱水各5 min，二甲苯透明，中性树胶封片。组化染色中PBS代替一抗作为阴性对照。

1.3.2 RT-PCR检测THBS4mRNA在胃癌中的表达:总RNA的提取:RIZOL试剂一步法总RNA提取，用紫外分光光度计测定总RNA的浓度。

1.3.3 cDNA的合成:用mRNA发转录成cDNA，各取5μg总 RNA，分别加入0.4μl oligodT，后加 DEPC-treated H2O至 20 μl，70℃，10 min变性，迅速插冰冷却。各 加 入 5 × RT buffer 6 μl，dNTP 2 μl(2.5 mmol/L)，RNase抑制剂 0.5 μl(40 U/μl)，充分混匀。加入M-MLV逆转录酶各1μl，轻轻混匀，37℃孵育1 h，70℃ 15 min灭活，终止反应。

1.3.4 设计引物，序列为:THBS4:202 bp

每次PCR反应均设置no-template阴性对照，以1μl ddH2O代替模板，消除体系污染造成的假阳性。PCR反应在Biometra热循环仪中进行。

1.4 反应条件 94℃预变性4 min。循环参数:94℃30 s;55℃ 45 s;72℃ 30 s。32 个循环后，72℃ 延伸10 min。

1.5 结果判定

1.5.1 免疫组化的结果判定:THBS4蛋白在细胞胞浆，及胞膜出现淡染的棕黄色颗粒;着色大于等于10%为阳性，小于10%为阴性。

1.5.2 THSB4的RT-PCR阳性表达结果判定:PCR产物行2.0%琼脂糖凝胶(含0.25μg/ml EB)电泳。分别取样品PCR产物6μl以80 V电压电泳约30 min，凝胶成像系统观察结果，照相记录实验结果。

1.6 统计学分析 应用SPSS17.0统计软件，临床病理指标与表达程度之间采用χ2检验，当n≥40但有1≤T＜5时，以及n＜40或T＜1时，四格表资料结果采用fisher确切概率法检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌组织中THBS4 mRNA的表达情况 胃癌组织中THBS4 mRNA表达阳性者39例(65.0%)，表达阴性者21例(35.0%)，在不同分化胃癌组织中呈现差异表达(图1)。

图1 RT-PCR检测不同分化胃癌组织THBS4的差异表达

2.2 胃癌组织中THBS4 mRNA的差异表达与不同临床病理指标间的关系 在60例胃癌标本中THBS4mRNA阳性表达39例，阳性表达率65.0%。男性表达23例，阳性率60.5%，女性中表达16例，阳性率72.7%，差异无统计学意义(P＞0.05)。在不同的年龄组THBS4mRNA的表达差异无统计学意义(P＞0.05)。在高分化组中THBS4mRNA的阳性表达率为50.0%，中分化组阳性表达率为47.6%，低分化组阳性表达率为82.7%，在组内进行两两比较，高分化与中分化胃癌的表达差异无统计学意义(P＞0.05)，与低分化的胃癌相比差异有统计学意义(P＜0.05)。中分化组与低分化组相比差异有统计学意义(P＜0.05)。有淋巴结转移组THBS4mRNA阳性表达率为78.8%，无转移组阳性表达率为48.1%，差异有统计学意义(P＜0.05)。THBS4mRNA阳性表达在临床分期差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

表1 胃癌组织中THBS4 mRNA在不同临床病理指标的表达

2.3 免疫组织化学检测结果

2.3.1 THBS4蛋白的在胃癌组织中的表达:在胃癌组织检测THBS4蛋白的表达:在正常胃黏膜细胞胞浆内无棕色颗粒，在高分化胃癌组织中有癌细胞胞浆着色，染色较淡。在中分化的胃癌细胞中棕色颗粒染色加深，低分化胃癌细胞胞浆及胞核内弥漫出现深染的棕色颗粒 (图2)。

图2 THBS4在不同胃黏膜组织中的表达

2.3.2 胃癌组织中THBS4蛋白阳性表达与病理指标之间的关系:在60例胃癌组织中THBS4蛋白阳性34例，阳性表达率为56.7%，THBS4蛋白的阳性表达与胃癌患者的年龄及性别差异无统计学意义(P＞0.05)。THBS4蛋白在胃癌高分化组阳性表达率为40.0%，在中分化阳性表达38.1%，在低分化组阳性表达为75.8%，与低分组相比差异有显著性(P＜0.05)。THBS4蛋白的阳性表达在淋巴转移组高于无淋巴结转移，差异有统计学意义(P＜0.05)。THBS4蛋白的阳性表达在临床病理分期差异有统计学意义(P ＜0.05)。见表2。

表2 胃癌组织中THBS4蛋白阳性表达与病理指标的关系

3 讨论

THBS4基因是THBS家族新成员，它的结构与这个家族其他成员基本相同，有一个球状的氨基端和一个球状的羧基端。N末端区域的氨基酸残基与肝素结合调节细胞间接触、游走、增殖及血小板聚集。C末端可与整合蛋白相关蛋白(IAP)结合，介导细胞粘附、游走、血小板聚集。但在N端缺少原胶原同源重复序列和备解素重复序列，两个半光氨酸残基在原胶原同源区，THBS4的这种分子结构决定了残基的多肽性，而且THBS4的出现与该家族相比极大的限制了在其他组织中的表达，它高表达于正常心肌和骨骼肌［1］。它在心脏的发育和骨骼肌的发育中起了重要作用。THBS4是细胞外基质，它可以促进细胞的增生与黏附，可以促进神经细胞的成熟［2］。THBS4结构中由于没有原胶原同源区来抑制血管内皮细胞增生;没有备解素重复序列，不能诱导血管内皮细胞的凋亡，这可能是THBS4基因促进血管形成原因之一。THBS4在肿瘤中的研究较少，有学者在结直肠癌中研究发现，THBS4在结直肠癌中表达比正常肠黏膜还低，这种THBS4的表达缺失［3］，说明了THBS4可以导致肿瘤细胞的选择性生长优势。在有些肿瘤中过表达，可以显著抑制肿瘤细胞生长的能力［4］。有学者研究THBS4基因与动脉粥样的发生有关［5］。在本组实验中THBS4蛋白在中低分化胃癌中表达比高分化胃癌高，在胞浆内的着色也随着胃癌分化程度的降低而加深，差异有统计学意义(P＜0.05)。在淋巴转移组中THBS4蛋白表达比无淋巴转移组高，差异有统计学意义(P＜0.05)。THBS4-mRNA与蛋白在胃癌组织中表达说明 THBS4对细胞的增殖起了上调作用，促进了细胞大量增生。发生的机制不清楚，可能与THBS4特定的分子结构有关，THBS4基因使caspas3活性降低从而使本应进入凋亡程序的细胞没有被识别，得以生存并增殖。有文献报道THBS4正常情况下高表达在心肌和骨骼肌，在肺组织、胰腺、脑组织、结肠中仅有少量的表达，而在胎盘、肝脏、肾脏中无表达［6］。

综上所述，THBS4基因是一种细胞外基质的糖蛋白，在胃癌组织中呈阳性表达，与胃癌的分化程度有关，在中低分化的胃癌中高表达，与浸润深度有关，随浸润的深度阳性表达越高，与淋巴转移有关，在淋巴转移组阳性表达比无转移组高。THBS4的阳性表达可以上调CTGF的表达，在高分化胃癌中CTGF的阳性表达低于低分化胃癌，差异有显著性。THBS4通过P53蛋白的突变抑制了细胞的凋亡，促进胃癌细胞的增殖与分化;促进了内皮细胞的增生，有利于血管的形成。随着THBS4蛋白阳性表达增高血管密度也增加，差异有显著性。THBS4基因具有多种功能，在肿瘤的形成中通过多种途径发挥作用。THBS4基因在胃癌中可作为判断与预后的指标。

1 Lawler J，Duquette M，Whittaker CA，et al.Identification and Characterization of Thrombospondin-4，a New Member of the Thrombospondin Gene Family.JCell Biol，1993，120:1059-1067.

2 Arber S，Caroni P.Thrombospondin-4，an extrace uular matrix protein expressed in the developing and adult nervous system promotes neurite outgrowth.J Cell Biol，1995，131:1083-1094.

3 Greco SA，Chia J，Kelly J，et al.Thrombospondin-4 is a putative tumoursuppressor gene in colorectal cancer that exhibits age-related methylation.BMC Cancer，2010，10:494.

4 Lawler J，McHenry K，Duquette M，et al.Characterizationofhumanthrombospondin-4.Biol Chem，1995，270:2809-2814.

5 Frolova EG，Pluskota E，Krukovets I，et al.Thrombospondin-4 regulates vascul inflammation and atherogenesis.Circ Res，2010，107:1313-1325.

6 Adams JC，Watt FM.Regulation of development and differentiation by the extracellular matrix.Development(Camb)，1993，117:1183-1198.