郭楚楚，程轩轩，李嘉荣，唐晓敏，张春荣，杨全

(广东药学院 中药学院，广东 广州 510006)

中药工业

超声波协同半仿生法提取广金钱草总黄酮工艺研究△

郭楚楚，程轩轩，李嘉荣，唐晓敏，张春荣，杨全*

(广东药学院 中药学院，广东 广州 510006)

目的：研究超声波辅助半仿生法提取广金钱草总黄酮的最佳工艺条件。方法：在单因素试验的基础上，根据Box-Behnken设计原理采用三因素三水平响应面分析方法，考察料液比、超声功率和提取时间对总黄酮得率的影响，建立二次多项式回归方程的预测模型。绘制以总黄酮含量为响应值的等高线图和响应曲面，讨论各因素间的交互作用。结果：回归模型拟合性良好，置信度较高。优选的提取工艺为：以pH=2.0，7.5，8.3的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液为提取溶剂，料液比为1∶40，室温下超声提取39 min，重复提取3次，功率为340 W。在此条件下，总黄酮的提取量为1.879 4 mg·g-1，与预测值相符度为96%。结论：采用响应面优化的半仿生提取工艺稳定可行，不使用有机试剂有利于降低生产成本，实现绿色化生产。

广金钱草；总黄酮；半仿生法；响应面法

广金钱草为豆科植物广金钱草Desmodiumstyracifolium(Osb.)Merr.的干燥地上部分，异名马蹄草、落地金钱。本品性凉，味甘、淡，具有利湿退黄、利尿通淋的功能，用于黄疸尿赤，热淋，石淋，小便涩痛、水肿尿少[1]。广金钱草在民间用于治疗肾、肝、胆结石，疗效显著，是一种具有广阔开发前景的广东道地药材[2]。本品既可以不带根全草入药，还可作为主要原料生产中成药，如“消石饮”、“石淋通”、“消炎利胆片”、“消石片”、“金钱草冲剂”等，临床应用广泛[3]。植物化学研究表明广金钱草中含有黄酮、生物碱、酚类、鞣质和多糖等成分[1]。现代药理已证实广金钱草总黄酮能明显增加小鼠心肌营养性血流量、在体狗冠脉及脑血流量、小鼠常压缺氧耐受力，缓解家兔离体血管条的痉挛，在体外还能显著抑制血小板聚集和血栓形成[4-5]。

半仿生提取法是从生物药剂学的角度将整体药物研究法与分子药物研究法相结合，模拟口服药物在胃肠道的转运过程，采用不同pH值的酸性水和碱性水依次连续提取的方法，其目的是尽可能地提取和保留原药中的有效成分[6-8]。此法具有适合工业化生产、同时体现中医防病综合成分作用的特点[9]。本研究采用超声波协同半仿生法对广金钱草总黄酮的提取工艺进行优化，以总黄酮含量为评价指标，在单因素试验基础上采用响应面法组合设计试验，以期筛选最佳提取工艺参数，为进一步开发利用广金钱草提供参考。

1 仪器与材料

KQ-500DE型数控超声波清洗器(江苏省昆山市超声仪器有限公司)；YJ-10高速中药粉碎机(上海永久制药机械有限公司)；UV-2450紫外分光光度计(日本岛津公司)；FA2204B电子天平(上海精科天美科学仪器有限公司)；PHS-25型数字pH计(上海盛磁仪器有限公司)；PH2T-92VOA电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；DK-S26电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司)；TG-16WS台式高速离心机(长沙湘智离心机仪器有限公司)。

广金钱草购于广东清平中药材市场，经广东药学院杨全教授鉴定为豆科植物广金钱草Desmodiumstyracifolium(Osb.)Merr.的全草；芦丁对照品(上海金穗生物科技有限公司，批号：20130509，纯度>98%)；磷酸二氢钠、柠檬酸、氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝、盐酸、乙醇等均为分析纯(天津百世化工有限公司)，实验用水为蒸馏水(文中无特殊说明的溶液，配制溶剂均为蒸馏水)。

2 方法与结果

2.1 标准曲线的绘制

精确称取芦丁对照品5 mg，用60%乙醇溶解，定容至50 mL，制成0.1 mg·mL-1的芦丁对照品溶液。分别吸取0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mL置于10 mL容量瓶中，依次加入60%乙醇1 mL、5%亚硝酸钠(NaNO2)溶液0.3 mL，摇匀后放置10 min；加入10%硝酸铝[Al(NO3)3]溶液0.3 mL，摇匀后放置10 min；加入4%氢氧化钠(NaOH)溶液2.0 mL，最后用60%乙醇定容至10 mL，摇匀静置15 min。于510 nm处测定吸光度，以吸光度Y为纵坐标，总黄酮的质量浓度X(mg·mL-1)为横坐标绘制标准曲线，得到回归方程为Y=10.24X-0.065(r=0.999 9)，线性范围为20.0～60.0 μg·mL-1。

2.2 供试品溶液的制备

根据仿生学原理，人体胃、小肠、大肠的体液酸度最佳pH分别为2.0，7.5，8.3[10]。准确称取干燥的广金钱草粉末(过二号筛)1 g，置于具塞锥形瓶中，依次加入pH为2.0，7.5，8.3的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液作为提取溶剂，在一定的料液比、功率和时间条件下超声提取，过滤，合并3次提取液，浓缩，定容。

2.3 样品测定

准确吸取广金钱草提取液2 mL，置于10 mL容量瓶中，按照2.1方法依次加入NaNO2、Al(NO3)3和NaOH溶液，摇匀静置后，用60%乙醇定容至刻度线，于510 nm处测定吸光度。根据芦丁标准曲线方程计算广金钱草总黄酮的提取率。计算公式：X=C×V1×V2/(M×V3)，X为样品中总黄酮质量分数(mg·g-1)；C为标准曲线中黄酮的质量浓度(mg·mL-1)；V1为稀释体积(mL)；V2为样品溶液体积(mL)；M为样品重量(g)；V3为取样体积(mL)。

2.4 单因素试验

2.4.1 料液比对总黄酮提取率的影响 精密称取广金钱草粉末6份，每份1 g，置于具塞锥形瓶中，料液比分别为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60，在功率为300 W条件下于pH为2.0，7.5，8.3的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液中分别超声提取，每次提取30 min，合并3次提取液，浓缩，定容。其余操作同2.3方法，考察料液比对广金钱草总黄酮提取量的影响，结果见图1。随着料液比的增加，黄酮提取量呈上升趋势，但当料液比达到1∶40后，总黄酮量的增加趋于平缓，说明黄酮的浸出已达动态平衡。从提取效果、减少溶剂用量和降低浓缩负荷等方面综合考虑，最佳料液比确定为1∶40。

图1 液料比对总黄酮提取量的影响

2.4.2 超声时间对总黄酮提取率的影响 精密称取广金钱草粉末6份，每份1 g，置于具塞锥形瓶中，在料液比为1∶40、功率为300 W条件下于pH为2.0，7.5，8.3的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液中分别超声提取，每次提取时间为10，20，30，40，50，60 min，合并3次提取液，浓缩，定容。其余操作同2.3方法，考察超声时间对广金钱草总黄酮提取量的影响，结果见图2。广金钱草总黄酮的提取量随着超声时间的延长而增加，但是达到40 min后，进一步增加提取时间，总黄酮含量出现了明显的下降趋势。过长时间的超声波作用可能导致部分黄酮发生降解，含量随之下降。

图2 超声时间对总黄酮提取量的影响

2.4.3 超声功率对总黄酮提取率的影响 精密称取广金钱草粉末6份，每份1 g，置于具塞锥形瓶中，按照1∶40的料液比于pH为2.0，7.5，8.3的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液中分别超声提取，提取功率分别为250，300，350，400，450，500 W，每次提取40 min，合并3次提取液，浓缩，定容。其余操作同2.3方法，以考察功率对黄酮含量的影响。由图3可知，功率越高对药材细胞的破坏作用越大，溶剂扩散也越快，越有利于有效成分的浸出。当功率大于350 W时，进一步增加功率则黄酮含量反而下降，可能由于过高的超声功率产生的瞬间高温会使黄酮类成分遭到破坏，同时杂质溶出较多，故确定350 W为适宜的提取功率。

图3 超声功率对总黄酮提取量的影响

2.5 响应面法优化广金钱草总黄酮提取工艺

2.5.1 BBD试验设计与结果 根据Design Expert 8.0.5软件中的Box-Behnken试验设计原理[11-12]，综合单因素试验结果，选取料液比、超声功率和提取时间3个因素，采用三因素三水平的响应面分析方法，共设计17个试验点，设计及结果见表1、表2。

表1 广金钱草总黄酮提取工艺响应面分析因素与水平表

表2 广金钱草总黄酮提取工艺响应面分析方案及结果

2.5.2 模型的建立及回归分析 采用响应面法分析试验结果，得到以广金钱草总黄酮含量为响应值的回归方程：Y=1.760 6+0.014 5A-0.020 7B-0.204 1C-0.028 9AB+0.022 2AC-0.034 7BC+0.013 2A2-0.152 5B2-0.454 4C2。式中Y为总黄酮质量分数(mg·g-1)；A为料液比；B为提取时间(min)；C为超声功率(W)。

由表3回归模型方差分析可知，二次方程模型的“Prob>F”值<0.000 1，表明该二次方程模型极显著，说明该试验方法可靠，使用该方程模拟真实的三因素三水平分析是可行的。同时，失拟相P=0.116 7>0.05(不显著)，表明模型不存在失拟因素，试验结果与数学模型拟合良好，即可以用该数学模型推测试验结果。其方程的相关系数r=0.997 616，rAdj=0.994 551，表明99.76%的数据可以用该方程解释。变异系数CV=1.45%，反映模型的置信度较高，模型方程能较好反映真实的试验值，可用此模型分析响应值的变化。由“Prob>F”值可知，B、C、AB、BC、B2、C2均为二次回归模型的显著性因素(P<0.01)。3个主因素对总黄酮得率的影响顺序为：功率>时间>料液比。

表3 广金钱草总黄酮提取工艺回归模型方差分析

图4～6是根据回归方程所得的各因素对总黄酮含量影响的三维响应曲面和等高线图。图中分别将超声功率、料液比和提取时间固定在0水平，可以直观分析各因素及任意两因素之间的交互作用对总黄酮含量影响效应的大小。图4和图5的等高线密集且呈椭圆形，响应面较陡，说明料液比和提取时间、提取时间和超声功率之间的交互作用显著。此结论可验证表3的方差分析结果。

应用Design Expert软件对试验进行最优化设计，得到最佳提取工艺参数：料液比为1∶40，提取时间为38.6 min，超声功率为340.29 W，预测响应值广金钱草总黄酮质量分数为1.809 5 mg·g-1。

2.5.3验证实验 准确称取广金钱草粉末1 g，在最佳条件下提取，重复实验5次，计算总黄酮的平均质量分数为1.879 4 mg·g-1，与预测值相符度为96.28%。

3 讨论

图4 料液比和提取时间对总黄酮得率的三维响应面与等高线图

图5 提取时间和超声功率对总黄酮得率的三维响应面与等高线图

图6 料液比和超声功率对总黄酮得率的三维响应面与等高线图

响应面分析(RSM)是利用合理的试验设计，采用多元二次回归方程拟合因素与响应值之间的函数关系，通过分析回归方程来求得最佳工艺参数，以解决多变量问题的一种统计方法。具有试验周期短、回归方程准确度高、能研究多因素交互作用等优点[9]。

采用半仿生法提取广金钱草中总黄酮，用响应面分析法考察料液比、提取时间、超声功率对总黄酮得率的影响，结果表明：在考察的因素水平范围内，提取时间、超声功率对总黄酮得率的影响分别具有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，因素间的交互作用明显。经过工艺优化，考虑到操作的方便性，广金钱草总黄酮的最佳提取条件调整为：料液比1∶40，提取时间39 min，超声功率340 W，用此工艺提取总黄酮质量分数可达1.879 4 mg·g-1。半仿生提取法模拟人体口服给药过程，不使用有机试剂，减少对环境及生产人员的身体伤害，利于降低生产成本，实现绿色化生产。

[1] 国家药典委员会.中国药典 [S].一部.北京：中国医药科技出版社，2010：41.

[2] 曹进，陈孟莉，叶兆波，等.广金钱草药材的质量相关性研究[J].中草药，2010，41(4)：643-647.

[3] 李锐.广金钱草化学成分及分析方法的研究进展[J].中国药业，2009，18(16)：86-87.

[4] 范文昌，梅全喜，赖海标.广金钱草的药理作用和临床应用研究进展[J].中国药房，2010，21(31)：2961-2963.

[5] 简洁莹.广金钱草提取物对实验性心肌缺血的保护作用[J].广东医学，1983，4(6)：33.

[6] 赖红芳，吴志鸿，邓晰朝.半仿生法提取了哥王总黄酮的工艺研究[J].安徽农业科学，2011，39(25)：15251-15253.

[7] 杜松云，赵淼，李其兰.正交试验法优选苦参的半仿生法提取工艺条件[J].亚太传统医药，2013，9(3)：28-30.

[8] 陈晓娟，周春山.酶法及半仿生法提取杜仲叶中绿原酸和黄酮[J].精细化工，2006，23(3)：257-260.

[9] 马涛，毛红燕，石太渊，等.五味子多糖的微波辅助—半仿生提取工艺优化[J].中国食品学报，2011，11(1)：98-105.

[10] 王蕙，付燕，郎久义.酶法及半仿生法提取银杏黄酮的工艺研究[J].辽宁中医药大学学报，2009，11(2)：146-148.

[11] 林建原，季丽红.响应面优化银杏叶中黄酮的提取工艺[J].中国食品学报，2013，13(2)：83-90.

[12] 彭晓莉，刘新，陈卫中，等.响应面优化龙眼核原花青素的醇提工艺[J].食品工业科技，2012，33(8)：305-313.

StudyonExtractionTechnologyofTotalFlavonoidsfromDesmodiumstyracifoliumbyUltraconicandSemi-bionicMethods

GUO Chuchu，CHENGXuanxuan，LIJiarong，TANGXiaomin，ZHANGChunrong，YANGQuan*

(SchoolofTraditionalChineseMedicine，GuangdongPharmaceuticalUniversity，Guangzhou510006，China)

Objective:To optimize ultrasonic and semi-bionic extraction conditions for total flavonoids fromDesmodiumstyracifolium.Methods：According to Box-Behnken design principle and results of single-factor experiments，the effects of liquid/solid ratio，ultrasonic power and ultrasonic time on the total flavonoids yield were explored by three factors and three levels of response surface analysis method.The prediction model for quadratic polynomial regression equation was established，and the response surface and contour line map were analyzed to discuss the interaction between different factors.Results：Regression model had good fitness and confidence.Optimum extraction technology conditions were as follows：the extracting solvent was disodium hydrogen phosphate-citric acid buffer solution(pH=2.0，7.5 and 8.3)，and the ratio of solid-liquid was 1∶40；the ultrasonic time was 38.6 min for 3 times and ultrasonic power was 340 W.Under the optimal conditions，the extract of total flavonoids was 1.879 4 mg·g-1and the predictable value was 1.809 5 mg·g-1.Conclusion：The optimized extraction technology was stable and low-cost，which could be used for non-pollution production.

Desmodiumstyracifolium；Total flavonoids；Semi-bionic method；Response surface method

2014-04-15)

广东省中山市科技局华南现代中医药城项目(20101H020)

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杨全，教授，研究方向：中药资源与道地性研究；E-mail：yangquan7208@vip.163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.12.013