何鹏，王英，金建平，金阳，吴敏

(1.芜湖市食品药品检验所，安徽 芜湖 241006；2.暨南大学 药学院，广东 广州 510632)

HPLC同时测定广东王不留行中绿原酸和芦丁的含量

何鹏1*，王英2，金建平1，金阳1，吴敏1

(1.芜湖市食品药品检验所，安徽 芜湖 241006；2.暨南大学 药学院，广东 广州 510632)

目的：运用高效液相色谱法(HPLC)建立广东王不留行中绿原酸和芦丁的含量测定方法。方法：色谱柱为Inersil ODS-3 C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为甲醇(A)-1%醋酸水溶液(B)，梯度洗脱，检测波长为340 nm，柱温为40 ℃，流速为1.0 mL·min-1。结果：绿原酸在0.101 6～1.015 5 μg与峰面积线性关系良好(r=1.000 0，n=5)；芦丁在0.021 5～0.214 9 μg与峰面积线性关系良好(r=1.000 0，n=5)。绿原酸的平均加样回收率为98.3%，RSD=1.53%(n=6)；芦丁的平均加样回收率为102.9%，RSD=1.46%(n=6)。结论：所用方法操作简单、快捷、准确，可用于广东王不留行的质量控制。

广东王不留行；绿原酸；芦丁；高效液相色谱法

广东王不留行为桑科植物薜荔FicuspumilaL.的干燥隐头花序托，具有活血通经、补肾固精功能，主治乳汁不下，阳痿遗精，闭经，久痢脱肛等[1]。主要分布于我国广东、广西、江苏、四川等地[2]。广东王不留行目前收载于《中国药典》2010版一部附录Ⅲ，未收载于标准正文中，《中国药典》2015版一部正文拟将收载此品种。目前广东王不留行中黄酮类成分的含量测定研究已有报道[3]，但是同时测定绿原酸和芦丁含量的文献尚未见报道。本文采用HPLC同时测定广东王不留行中绿原酸和芦丁两种指标成分，结果表明此法简便快捷，准确可靠，为广东王不留行的质量控制提供参考。

1 仪器与试药

Waters e2695高效液相色谱仪；Waters 2489紫外检测器；JU-2106超声波清洗器(上海杰恩普公司)；Mettler Toledo XP205电子分析天平(瑞士梅特勒托利多公司)；KEDA UV-VIS 8500紫外-可见分光光度计(无锡科达公司)。

绿原酸对照品(中国食品药品检定研究院，含量：96.6%，批号：110753-201314)；芦丁对照品(中国食品药品检定研究院，含量：90.5%，批号：100080-200707)；甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯；广东王不留行(共收集15批，产地均为广东，批号：20130301，20130311，20130321，20130325，20130406，20130413，20130418，20130426，20130512，20130517，20130523，20130527，20130605，20130402，20130805)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Inersil ODS-3 C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为甲醇(A)-1%醋酸水溶液(B)，梯度洗脱，洗脱程序见表1；检测波长为340 nm；柱温为40 ℃；流速为1.0 mL·min-1；进样量为10 μL。理论板数按芦丁峰计算应不低于3 000。在此条件下绿原酸峰和芦丁峰与其他相邻色谱峰均达到有效分离，分离度均大于1.5，见图1。

表1 流动相梯度洗脱程序

A.绿原酸、芦丁混合对照品 B.广东王不留行样品图1 广东王不留行样品及对照品溶液HPLC图

2.2 对照品溶液的制备

精密称取绿原酸对照品13.14 mg，置10 mL量瓶中，加入50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得绿原酸对照品储备液(1.269 3 mg·mL-1)；精密称取芦丁对照品14.84 mg，置50 mL量瓶中，加入50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得芦丁对照品储备液(0.268 6 mg·mL-1)；分别精密量取上述两种储备液各2 mL，置同一50 mL量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液(其中绿原酸质量浓度为0.050 8 mg·mL-1，芦丁质量浓度为0.010 7 mg·mL-1)。

2.3 供试品溶液的制备

取广东王不留行粉末(过二号筛)约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250 W，频率33 kHz)40 min，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 线性关系考察

分别精密吸取混合对照品溶液2，5，10，15，20 μL，注入高效液相色谱仪，按2.1色谱条件测定峰面积。以峰面积为纵坐标(Y)，分别以绿原酸、芦丁的进样量为横坐标(X)，绘制绿原酸和芦丁的标准曲线，得绿原酸回归方程：Y=2 787 075.756 5X-96 639.285 4(r=1.000 0)；芦丁回归方程：Y=1 747 157.771 8X-19 431.269 5(r=1.000 0)。绿原酸在0.101 6～1.015 5 μg、芦丁在0.021 5～0.214 9 μg与峰面积线性关系良好。

2.5 精密度试验

精密吸取混合对照品溶液10 μL，照2.1色谱条件，连续进样6次，记录峰面积。结果绿原酸和芦丁的RSD分别为0.65%和0.70%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

取广东不留行样品(批号：20130301)1份，按2.3方法制备供试品溶液，室温放置，分别于0，2，4，6，8 h时进样测定，记录峰面积。结果绿原酸和芦丁的RSD分别为0.64%和0.54%，表明供试品溶液室温下至少在8 h内稳定。

2.7 重复性试验

取同一批样品(批号：20130301)6份，分别按2.3方法制备供试品溶液，进样测定含量。结果绿原酸和芦丁的RSD分别为0.96%和1.43%，表明方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验

取已知含量的样品(批号：20130301，绿原酸质量分数：0.271%，芦丁质量分数：0.061%)6份，每份0.5 g，精密称定，分别精密加入一定量的绿原酸对照品和芦丁对照品，按2.3方法制备供试品溶液，进样测定，计算回收率，结果见表2、3。

表2 广东王不留行中绿原酸加样回收试验

注：绿原酸对照品加入量均为1.269 3 mg

表3 广东王不留行中芦丁加样回收试验

注：芦丁对照品加入量均为0.268 6 mg

2.9 广东王不留行样品含量测定

取15批广东王不留行样品，按2.3方法制备供试品溶液，进样测定绿原酸及芦丁的质量分数，结果见表4。

表4 广东王不留行样品中绿原酸及芦丁的测定 %

3 讨论

3.1 药材名称的考证

很多地方存在广东王不留行与《中国药典》2010版收载的石竹科药材王不留行混用的情况，尤其在广东、广西、河南等地区习惯将广东王不留行当作王不留行使用[4]，在这些地区广东王不留行常被称为薜荔果、凉粉果、木馒头、广东王不留行[5]。《中国药典》2015版将把广东王不留行作为正式法定名称，与石竹科的王不留行严格区分。

3.2流动相的选择

资料[6-8]，考察了不同比例的甲醇-0.4%磷酸溶液、乙腈-0.4%磷酸水溶液、甲醇-1%冰醋酸水溶液、甲醇-水的多种等度和梯度洗脱，结果发现等度洗脱运行时间在40 min以上时绿原酸和芦丁与各自相邻峰的分离度才能大于1.5；选用磷酸时指标成分拖尾因子略高于使用醋酸时得到的结果；以甲醇-1%冰醋酸水溶液按表1中规定进行梯度洗脱时绿原酸和芦丁峰保留时间适中，基线平稳，峰形理想，目标成分峰与相邻峰的分离度均大于1.5，故按表1中的梯度程序作为流动相。

3.3提取条件的选择

本文首先考察了50%甲醇、甲醇、乙酸乙酯的提取效果，结果以50%甲醇-水溶液的提取效果最好；通过比较超声提取法和加热回流提取法，发现超声提取效果较好且操作更简便；通过比较不同固液比(1∶25，1∶50，1∶75，1∶100)提取率，发现1∶25时提取效果差，后3个比例效果差别不大，从环保及节约试剂考虑，选择加入溶剂量为50 mL；超声时间考察了10，20 ，40，60 min，发现指标成分含量随着提取时间先增大后减小，当超声处理40 min时最大，故选择超声时间为40 min。

3.4检测限和定量限

根据《中国药典》2010版一部附录XⅧ A中药质量标准分析方法验证指导原则的规定[6]，按照国家药典委员会颁布的《〈中国药典〉中药质量标准研究制定技术要求》、《〈中国药典〉中药质量标准起草与复核工作规范》和《〈中国药典〉中药质量标准起草说明编写细则》等相关文件的要求，本研究未考察检测限和定量限，而且标准曲线中浓度最低点的绿原酸和芦丁峰面积分别为19万和2万左右，峰面积较大，可推算出检测限和定量限非常小，没有必要考察验证检测限和定量限。

3.5含量的差异

本研究选择了15批样品进行测定，结果个别批次含量偏差较大，分析可能的原因有：药材来源于花序托即为薜荔果的果壳，体积较大，对取样均匀性要求较高；果实的成熟度可能与含量也有着一定的关系；收集样品过程中发现部分果壳内带有较多的种子，同一药材中种子与果壳的含量也可能存在一定的差异。这些可能造成含量偏差的原因在今后的工作中将作进一步的研究考证。

参考文献

[1] 侯士良.中药八百种详解[M].郑州：河南科学技术出版社，1999：922.

[2] 田承华.广西广东习用王不留行的本草考证[J].广西中医药，1999，22(3)：42.

[3] 张恩景，马莉.薜荔果的生药学研究及其黄酮的含量测定[J].中南药学，2013，11(8)：610-612.

[4] 张秋红，雷旭.药典载王不留行与广东地方用王不留行考证[J].海峡药学，2008，20(3)：81.

[5] 肖培根.新编中药志[M].北京：化学工业出版社，2002：102.

[6] 国家药典委员会.中国药典[S].一部.北京：中国医药科技出版社，2010：51,333.

[7] 潘海峰，王领弟，李艳荣，等.HPLC法同时测定山玫胶囊中8个成分的含量[J].药物分析杂志，2012，32(11)：1962-1967.

[8] 李玮，杨秀伟.HPLC法同时测定款冬花中9个主要成分的含量[J].药物分析杂志，2012，32(9)：1517-1524.

SimultaneousDeterminationfortheContentofChlorogenicAcidandRutinintheSeedofVaccariasegetalisbyHPLC

HE Peng1*，WANGYing2，JINJianping1，JINYang1，WUMin1

(1.WuhuInstituteforFoodandDrugControl，Wuhu241006，China；2.CollegeofPharmacy，JinanUniversity，Guangzhou510562，China)

Objective：To establish a method for detecting the content of Chlorogenic acid and Rutin in the seed ofVaccariasegetalisby high performance liquid chromatography(HPLC).Methods：The sample was separated on the Inersil ODS-3 C18column(250 mm×4.6 mm，5 μm),and was gradient elution using methanol(A)-1% acetic acid-water(B)as the mobile phase at a flow rate of 1.0 ml·min-1and at 40 ℃ of column temperature.The detection wavelength was 340 nm.Results：The linear range of Chlorogenic acid was at 0.101 6～1.015 5 μg(r=1.000 0，n=5)，and Rutin was at 0.021 5～0.214 9 μg(r=1.000 0，n=5).The average recovery rate was 98.3% for Chlorogenic acid，and the RSD was 1.53%(n=6).The average recovery rate was 102.9% for Rutin，and the RSD was 1.46%(n=6).Conclusion：This method is simple to handle，rapid and accurate，which can be used to control the quality for the seed ofVaccariasegetalis.

Vaccariasegetalis；Chlorogenic acid；Rutin；HPLC

2014-04-22)

*

何鹏，主管中药师，研究方向：药品标准和药品检验分析；Tel：(0553)5853053，E-mail：frankwade@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.12.007