万凯+丁晨红+邓义才+骆冲+梁应坤

摘 要 对蔬菜水果样品中的赤霉素残留量采用高效液相色谱方法进行测定。结果表明：样品中赤霉素经80%甲醇溶液提取，用石油醚脱色，经过乙酸乙酯液液萃取和磷酸缓冲液反萃取，再用乙酸乙酯萃取净化，然后采用C18色谱柱分离，以甲醇和0.1%的冰乙酸水溶液为流动相洗脱，用高效液相色谱紫外检测器206 nm波长检测，以保留时间定性，外标法定量。在此优化实验条件下，赤霉素标准溶液在0.25～50 mg/L呈良好线性，r=0.999 9，检出限为0.067 mg/kg。6种蔬菜水果的添加回收率为71.6%～105.2%，RSD为2.1%～9.8%。

关键词 赤霉素 ；高效液相色谱法 ；蔬菜 ；水果 ；残留

分类号 O657.7+2

Determination of Gibberellin Residue in Vegetables and Fruits by High Performance Liquid Chromatography

WAN Kai1，2） DING Chenhong1） DENG Yicai2） LUO Chong3） LIANG Yingkun1）

（1 Public Monitoting Center for Agro-product of Guangdong academy of agricultural science， guangzhou， Guangdong 510640；

2 Ministry of Agriculture Laboratory of Quality & Safety Risk Assessment for Agro-product（Guangzhou）， guangzhou， Guangdong 510640；

3 Centre for Quality Safety and Standard Research of Agricultural Products，

Guangdong Academy of Agricultural Sciences， guangzhou， Guangdong 510640）

Abstract Researched the analytical method for the determination of gibberellin acid residue in vegetables and fruit by high-performance liquid chromatography. The GA3 ， after being extrated by using 80% methoanol water solution，decolored by petroleum ether， extracted by ethyl acetace， and then， purged by reversed extraction with Phosphate Buffer（PB） and extrated with ethyl acetate again， was separated on C18 column using methonl and 0.1% acetic acid solution as mobile phases and 206 nm as HPLC detected wavelength. The samples were qualitatived by retention time and quantified with the external calibration method. The results showed the method performed well within the linear range between 0.25 mg/L and 50 mg/L （r=0.999 9）， and the limit of detection was 0.067 mg/kg. The method was used to detect the contents of GA3 in 6 kinds of vegetables and fruit， the recoveries for the spiked samples were ranged from 71.6% to 105.2%， and the variation coefficients were from 2.1% to 9.8%.

Keywords gibberellic acid （GA3） ； high performance liquid chromatography （HPLC） ； vegetable ； fruit ； residue

近年植物生长调节剂应用日益广泛，主要用作调节农作物的生长发育、提高产量和改良品质[1]。然而，植物生长调节剂也有一定的毒性，如赤霉素（gibberellic acid， GA）可能干扰人体正常的内分泌系统，长期食用可能会造成器官慢性中毒[2]；Erin等研究发现，赤霉素与肿瘤形成有一定关系[3]。赤霉素参与调节植物生长发育的多种生理过程，已被广泛应用于农业实际生产中[4]。由于一些种植者盲目追求高产及利润，乱用滥用赤霉素，使得蔬菜水果中残留大量赤霉素，进而使农产品安全存在潜在危害[5]。

目前，关于赤霉素残留量测定方法主要有酶联免疫检测法[6]、荧光法[7-8]、紫外分光光度法[9]、气相色谱法（GC）[10-11]、气相色谱串联质谱法（GC-MS）[12]、高效液相色谱法（HPLC）[5，12-17]、液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）[1，18-20]等。这些方法中有的前处理方法太过繁琐，有的灵敏度低，有的对仪器设备要求很高。HPLC是赤霉素检测的有效手段，但目前文献中的方法操作繁琐、净化效果以及灵敏度不能普遍适用于蔬菜水果中赤霉素残留量的检测要求。本实验对蔬菜水果中赤霉素残留量的HPLC检测方法进行了研究，优化样品前处理方法和检测条件。endprint

1 材料与方法

1.1 材料

岛津LC-20A高效液相色谱仪（配可变波长紫外检测器）；旋转蒸发仪；旋涡混合器；高速匀浆机；甲醇（色谱纯）；冰乙酸（色谱纯）；乙酸乙酯（分析纯）；石油醚（分析纯）；盐酸水溶液：1 mol/L的盐酸溶液；pH 6.2的磷酸盐缓冲液：1 000 mL蒸馏水中溶解6.7 g磷酸二氢钾和1.2 g氢氧化钠。赤霉素标准品（安谱）。

1.2 方法

1.2.1 标准储备液的配制

精确称取赤霉素（含量≥99.0%）0.1 g（精确到0.000 1 g），用甲醇溶解并定容至100 mL。此溶液浓度为每毫升相当于1.00 mg赤霉素。

1.2.2 样品处理方法的选择

1.2.2.1 提取溶剂

以甲醇和丙酮为提取剂，添加2.0 mg/kg赤霉素标准溶液测定回收率。

1.2.2.2 提取方法

以油麦菜为样品，采用高速匀浆2 min、超声波振荡15 min以及振荡30 min 3种提取方法进行效率比较。

1.2.2.3 净化条件

以番茄和油麦菜为样品，添加5.0 mg/kg赤霉素标准溶液，比较液液萃取结合C18 柱固相萃取和液液萃取结合反萃取2种净化方法的回收率。

1.2.3 色谱条件的选择

1.2.3.1 检测波长

查阅文献，发现赤霉素在200～400 nm波长内有较强的紫外吸收，通过紫外扫描确定最大的吸收峰，以此确定赤霉素的检测波长。

1.2.3.2 流动相

比较甲醇浓度分别为45%、60%、80%时，赤霉素的色谱峰分离效果。

1.2.4 方法的线性关系、检出限、精密度、重复性和准确性验证

将赤霉素标准溶液分别稀释成0.25、0.5、1、2.5、5、10、25、50 mg/L 8个不同浓度的标准溶液，在优化好的仪器条件下上机对其测定，以峰面积（Y）对质量浓度（X）回归作标准曲线。在同一实验室由同一操作者使用相同的前处理方法和设备，在短时间内对赤霉素含量进行5次测定。

选择3个不同的实验室对添加5.0 mg/kg赤霉素标准溶液的普通白菜样品进行重复性测定。

测定油麦菜、番茄、普通白菜、辣椒、香蕉和葡萄6种样品中添加赤霉素标准溶液（0.20、2.0、5.0、10.0 mg/kg）的回收率，以空白样品和加标样品的回收率为对照。重复3次。

2 结果与分析

2.1 提取条件的确定

2.1.1 提取溶剂

甲醇为提取剂时回收率为85.3%～92.1%，丙酮为提取剂时回收率为82.7%～107.3%。二者回收率接近，但甲醇价格低廉，毒性相对较低，因此本实验采用甲醇作为赤霉素的提取溶剂。

2.1.2 提取方法

高速匀浆、超声波振荡和振荡30 min提取的回收率分别为91.3%、86.4%和114.7%，都符合要求，但超声波震荡以及振荡提取所需时间长，且要求提取瓶密封性好，工作效率不高，故本实验采用高速匀浆法提取。

2.2 净化条件的选择

液液萃取结合C18柱固相萃取净化回收率为71.6%～89.5%，而液液萃取结合反萃取的回收率净化回收率为84.5%～96.1%。液液萃取结合反萃取净化效果好，目标峰附近干扰明显减少，因此本实验采用液液萃取结合反萃取净化。为更好的除去干扰，净化前采用石油醚除去样品中的色素。

2.3 色谱条件的选择

2.3.1 检测波长

赤霉素在200～400 nm波长范围内有较强的紫外吸收，通过紫外扫描可知赤霉素206 nm有最大吸收峰，因此本实验采用206 nm作为赤霉素的检测波长。

2.3.2 色谱柱

赤霉素是一种二萜类酸，属于中等极性的分子，因而固定相宜选择极性较小的键合固定相，流动相宜选择极性较强的溶剂。因此，本实验采用C18柱进行色谱分析。

2.3.3 流动相

赤霉素本身性质决定了其在温度低的酸性条件下比较稳定。赤霉素溶液在pH 3～4时最稳定。因此，本实验采用甲醇+0.1%冰乙酸水溶液为流动相。试验结果表明，45%的甲醇作为流动相时目标物的峰型较好，出峰时间较合适，且能与附近杂质分离开来。因此，采用甲醇+0.1%冰乙酸水溶液作为流动相，流动相配比为45+55。

2.4 液相色谱分析

图1为赤霉素标准溶液的液相色谱图，图2为油麦菜加标样品的高效液相色谱图。由图1～2可知，使用上述条件下进行样品分析，目标峰与样品中杂质峰基本达到基线分离，能够满足赤霉素的定性和定量要求。

2.5 方法的线性关系、检出限、精密度、重复性和准确性

赤霉素的线性关系y=4E-05x+0.278 5，相关系数r2=0.999 9，线性关系良好。赤霉素的最低检出浓度为0.067 mg/kg。由表1可知，本方法的相对标准偏差均<10%。由表2可知，本方法的RSD值均<10%，重复性能够满足实际应用的要求。由表3可知，回收率为71.6%～105.2%，RSD为2.1%～9.8%，变异系数均<10%，说明分析测试过程中无明显的系统误差，证明赤霉素的样品分析结果可靠。

2.6 建立的测定方法

2.6.1 样品前处理

准确称取20 g试样到250 mL三角瓶中，加入60 mL 80%的甲醇溶液，匀浆提取2 min，布氏漏斗抽滤，提取液转移至250 mL分液漏斗中，用20 mL甲醇溶液重复润洗滤渣2次，合并提取液；向提取液中加入20 mL石油醚，混匀、静止，去掉石油醚层。将脱色后的提取液在40℃下减压浓缩至约20 mL，加盐酸溶液调节pH 2.5～2.8后，加入20 mL乙酸乙酯反复萃取3次，合并乙酸乙酯相，减压浓缩至约20 mL，使用等量磷酸盐缓冲溶液反萃取3次，合并磷酸盐缓冲液，加盐酸溶液调节pH 2.5～2.8，再加入20 mL乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯相，40℃下减压蒸干。加入2 mL甲醇溶解残渣，过0.22 μm有机滤膜，装瓶供液相色谱分析。endprint

2.6.2 色谱条件

色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18 4.6 mm（I.D.）×250 mm，5 μm ；流动相：甲醇+0.1%冰乙酸水溶液（45+55）；流速：1.00 mL/min；柱温：40℃；进样量：10 μL；检测波长：206 nm。

3 讨论与结论

目前常用的农药残留提取溶剂有石油醚、乙酸乙酯﹑丙酮﹑乙腈。由于赤霉素易溶于醇类、丙酮﹑乙酸乙酯等有机溶剂和pH 6.2的磷酸缓冲液中。微溶于水﹑醚中，不溶于石油醚﹑苯﹑氯仿等溶剂中。赤霉素溶液呈酸性，低pH条件有利于萃取分离。在较强酸度下，赤霉素以稳定分子形式存在，提取率主要取决于其在醇中的溶解性能。pH增高，赤霉素存在状态发生改变，导致溶解性能变化。赤霉素常用的提取试剂有甲醇、乙酸乙酯和丙酮。鉴于乙酸乙酯虽然对大多数农药提取效率高，但其同时提取出大量油脂和色素，给净化和仪器测定都增加了难度。本试验分析甲醇和丙酮作为提取试剂，结果表明甲醇作为提取试剂。

赤霉素残留检测的净化方法主要有液液萃取、固相萃取以及液液萃取结合固相萃取。其中液液萃取又分为一步萃取和液液萃取结合反萃取2种。目前使用HPLC-MS/MS法测定赤霉素残留量多采用一步液液萃取或固相萃取净化，而HPLC法多使用液液萃取结合固相萃取；相对于HPLC-MS/MS而言，HPLC对净化的要求稍高，一步液液萃取以及固相萃取都不能很好的除去杂质干扰；而液液萃取结合固相萃取的净化方法操作繁琐、检测成本高。本研究对比了液液萃取结合C18固相萃取和液液萃取结合反萃取的净化效果，结果发现液液固相萃取结合反萃取操作更简便、更经济。

另外，有文献中使用206﹑210、220、254、278 nm等波长作为赤霉素检测波长[5，12，15-17]。通过紫外扫描可知赤霉素在206 nm处有最大吸收峰，在220和278 nm处有较小的吸收峰。在254和278 nm处杂质干扰少，但是吸收峰小不能很好的满足低浓度检测需求；而206 nm处响应值明显高于254和278 nm，虽然干扰物质相对较多，但可通过前处理的净化去除干扰。因此，本试验采用206 nm作为赤霉素的检测波长。

本研究建立了HPLC测定蔬菜水果中赤霉素残留量的方法。样品中赤霉素经80%甲醇溶液提取后，用石油醚脱色，经过液液萃取和反萃取净化，采用C18色谱柱分离，以甲醇+0.1%的冰乙酸水溶液为流动相洗脱，用高效液相色谱紫外检测器在206 nm波长检测。本研究建立的方法准确性好、灵敏度高、操作简单无需衍生、对仪器设备要求不高，易于推广使用，能满足日常检测需要。

参考文献

[1] 张 慧，吴 颖，路 勇，等. 超高效液相色谱-串联质谱法测定苹果中的赤霉素、脱落酸、甲萘威、多效唑和烯效唑残的残留量[J]. 食品工业科技，2010，31（10）：383-385

[2] 刘艳琴，王 浩，杨红梅，等. 高效液相色谱-串联四极杆质谱联用测定水果和蔬菜中赤霉素残留量[J]. 现代农业科技，2009，37（16）：330-331.

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[20] 徐生坚，曹 慧，陈小珍. 超高效液相色谱-串联质谱法测定粮谷中6种植物生长调节剂残留[J]. 食品科学，2013，34（18）：218-222.endprint

2.6.2 色谱条件

色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18 4.6 mm（I.D.）×250 mm，5 μm ；流动相：甲醇+0.1%冰乙酸水溶液（45+55）；流速：1.00 mL/min；柱温：40℃；进样量：10 μL；检测波长：206 nm。

3 讨论与结论

目前常用的农药残留提取溶剂有石油醚、乙酸乙酯﹑丙酮﹑乙腈。由于赤霉素易溶于醇类、丙酮﹑乙酸乙酯等有机溶剂和pH 6.2的磷酸缓冲液中。微溶于水﹑醚中，不溶于石油醚﹑苯﹑氯仿等溶剂中。赤霉素溶液呈酸性，低pH条件有利于萃取分离。在较强酸度下，赤霉素以稳定分子形式存在，提取率主要取决于其在醇中的溶解性能。pH增高，赤霉素存在状态发生改变，导致溶解性能变化。赤霉素常用的提取试剂有甲醇、乙酸乙酯和丙酮。鉴于乙酸乙酯虽然对大多数农药提取效率高，但其同时提取出大量油脂和色素，给净化和仪器测定都增加了难度。本试验分析甲醇和丙酮作为提取试剂，结果表明甲醇作为提取试剂。

赤霉素残留检测的净化方法主要有液液萃取、固相萃取以及液液萃取结合固相萃取。其中液液萃取又分为一步萃取和液液萃取结合反萃取2种。目前使用HPLC-MS/MS法测定赤霉素残留量多采用一步液液萃取或固相萃取净化，而HPLC法多使用液液萃取结合固相萃取；相对于HPLC-MS/MS而言，HPLC对净化的要求稍高，一步液液萃取以及固相萃取都不能很好的除去杂质干扰；而液液萃取结合固相萃取的净化方法操作繁琐、检测成本高。本研究对比了液液萃取结合C18固相萃取和液液萃取结合反萃取的净化效果，结果发现液液固相萃取结合反萃取操作更简便、更经济。

另外，有文献中使用206﹑210、220、254、278 nm等波长作为赤霉素检测波长[5，12，15-17]。通过紫外扫描可知赤霉素在206 nm处有最大吸收峰，在220和278 nm处有较小的吸收峰。在254和278 nm处杂质干扰少，但是吸收峰小不能很好的满足低浓度检测需求；而206 nm处响应值明显高于254和278 nm，虽然干扰物质相对较多，但可通过前处理的净化去除干扰。因此，本试验采用206 nm作为赤霉素的检测波长。

本研究建立了HPLC测定蔬菜水果中赤霉素残留量的方法。样品中赤霉素经80%甲醇溶液提取后，用石油醚脱色，经过液液萃取和反萃取净化，采用C18色谱柱分离，以甲醇+0.1%的冰乙酸水溶液为流动相洗脱，用高效液相色谱紫外检测器在206 nm波长检测。本研究建立的方法准确性好、灵敏度高、操作简单无需衍生、对仪器设备要求不高，易于推广使用，能满足日常检测需要。

参考文献

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[19] 王 璐，吴 倩，段春凤，等. 基质固相分散萃取-高效液相色谱-串联质谱法分析拟南芥中的赤霉素[J]. 色谱，2011，9（29）：923-92

[20] 徐生坚，曹 慧，陈小珍. 超高效液相色谱-串联质谱法测定粮谷中6种植物生长调节剂残留[J]. 食品科学，2013，34（18）：218-222.endprint

2.6.2 色谱条件

色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18 4.6 mm（I.D.）×250 mm，5 μm ；流动相：甲醇+0.1%冰乙酸水溶液（45+55）；流速：1.00 mL/min；柱温：40℃；进样量：10 μL；检测波长：206 nm。

3 讨论与结论

目前常用的农药残留提取溶剂有石油醚、乙酸乙酯﹑丙酮﹑乙腈。由于赤霉素易溶于醇类、丙酮﹑乙酸乙酯等有机溶剂和pH 6.2的磷酸缓冲液中。微溶于水﹑醚中，不溶于石油醚﹑苯﹑氯仿等溶剂中。赤霉素溶液呈酸性，低pH条件有利于萃取分离。在较强酸度下，赤霉素以稳定分子形式存在，提取率主要取决于其在醇中的溶解性能。pH增高，赤霉素存在状态发生改变，导致溶解性能变化。赤霉素常用的提取试剂有甲醇、乙酸乙酯和丙酮。鉴于乙酸乙酯虽然对大多数农药提取效率高，但其同时提取出大量油脂和色素，给净化和仪器测定都增加了难度。本试验分析甲醇和丙酮作为提取试剂，结果表明甲醇作为提取试剂。

赤霉素残留检测的净化方法主要有液液萃取、固相萃取以及液液萃取结合固相萃取。其中液液萃取又分为一步萃取和液液萃取结合反萃取2种。目前使用HPLC-MS/MS法测定赤霉素残留量多采用一步液液萃取或固相萃取净化，而HPLC法多使用液液萃取结合固相萃取；相对于HPLC-MS/MS而言，HPLC对净化的要求稍高，一步液液萃取以及固相萃取都不能很好的除去杂质干扰；而液液萃取结合固相萃取的净化方法操作繁琐、检测成本高。本研究对比了液液萃取结合C18固相萃取和液液萃取结合反萃取的净化效果，结果发现液液固相萃取结合反萃取操作更简便、更经济。

另外，有文献中使用206﹑210、220、254、278 nm等波长作为赤霉素检测波长[5，12，15-17]。通过紫外扫描可知赤霉素在206 nm处有最大吸收峰，在220和278 nm处有较小的吸收峰。在254和278 nm处杂质干扰少，但是吸收峰小不能很好的满足低浓度检测需求；而206 nm处响应值明显高于254和278 nm，虽然干扰物质相对较多，但可通过前处理的净化去除干扰。因此，本试验采用206 nm作为赤霉素的检测波长。

本研究建立了HPLC测定蔬菜水果中赤霉素残留量的方法。样品中赤霉素经80%甲醇溶液提取后，用石油醚脱色，经过液液萃取和反萃取净化，采用C18色谱柱分离，以甲醇+0.1%的冰乙酸水溶液为流动相洗脱，用高效液相色谱紫外检测器在206 nm波长检测。本研究建立的方法准确性好、灵敏度高、操作简单无需衍生、对仪器设备要求不高，易于推广使用，能满足日常检测需要。

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