张志强 贺杰峰 张瑜 兰志伟 赵浩亮

肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma ，HCC）是最常见的恶性肿瘤之一，发病率位居全球恶性肿瘤的第5位[1]。肝癌免疫治疗是目前研究的热点，但肝癌存在着严重的肿瘤免疫微环境抑制，从而影响了肝癌免疫治疗的效果[2]。实验动物肝癌模型的免疫微环境分析目前在国内罕见报道，本研究通过建立诱导性大鼠肝癌模型，并分析肝癌局部免疫微环境中免疫细胞以及因子水平的变化及意义，为进一步改善肝癌免疫微环境、加强免疫治疗的效果研究提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 动物和试剂 Wistar雄性大鼠 40只，体重180～220g，购自山西医科大学动物实验中心，在室内标准规定条件下饲养，室温20℃，每笼10只。二乙基亚硝胺（DEN）购自

美国Sigma公司。FITC-CD4单抗、PE-CD25单抗及同型对照FITC-IgG2b单抗、PE-IgG1单抗均购自美国BD公司。兔抗鼠IL-10、Treg多抗和SABC免疫组化试剂盒均购自北京博奥森公司。

1.2 方法

1.2.1 模型制作及分组 大鼠正常喂养1周后随机分为三组：肝癌模型组（20只）、生理盐水组（10只）、空白对照组（10只）。肝癌模型组：大鼠按100mg/kg给予DEN腹腔注射，1次/周。生理盐水组（10只）：按腹腔注射同比例生理盐水，1次/周。空白对照组（10只）：大鼠不做任何处理。实验期间正常饮食饮水。

1.2.2 流式细胞术(FCM)检测 Treg的数量比例：分别制备大鼠肝癌模型组癌组织、生理盐水组肝组织、空白对照组肝组织单个核细胞悬液 (1×107／ml)，取100μl细胞悬液，加入FITC-CD4单抗和 PE-CD25单抗，同时设同型抗体对照组(即加入等量的FITC-IgG2b单抗和PE-IgG1单抗)，以排除非特异性染色影响，避光放置20min。用FACSCalibur流式细胞仪检测CD4、CD25的表达。……