刘忠锦,张海燕,刘佳俊Δ,刘子慧

(1.齐齐哈尔医学院第一附属医院 神经内科,黑龙江 齐齐哈尔 161006;2.齐齐哈尔医学院 组胚教研室,黑龙江 齐齐哈尔 161006)

石杉碱甲对血管性痴呆大鼠胶质细胞源性神经营养因子的表达及氧化应激水平的影响

刘忠锦1,张海燕2,刘佳俊1Δ,刘子慧1

(1.齐齐哈尔医学院第一附属医院 神经内科,黑龙江 齐齐哈尔 161006;2.齐齐哈尔医学院 组胚教研室,黑龙江 齐齐哈尔 161006)

目的 探索石杉碱甲（huperzine A)对血管性痴呆大鼠胶质细胞源性神经营养因子（glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)的表达及氧化应激水平的影响。方法 雄性SD大鼠随机分为正常对照组、模型组、石杉碱甲组，每组12只。模型组和石杉碱甲组采用大脑中动脉永久性缺血模型，造模后7 d石杉碱甲组开始给药，0.1mg/（kg·d)，每天1次，连续灌胃给药30 d，正常对照组和模型组给予等容量蒸馏水。观察各组动物行为学变化、检测脑组织匀浆中乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase，AChE)、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD)活性和丙二醛（malondialdehyde，MDA)、一氧化氮（nitric oxide，NO)含量；观察脑组织病理形态学变化；原位杂交法检测GDNFmRNA的含量。结果 石杉碱甲可以缩短模型大鼠学习反应时间，延长记忆时间，减少错误次数（P＜0.05)；增强大鼠脑组织中SOD活性，降低胆碱酯酶活性，MDA和NO含量减少（P＜0.05)；形态学观察结果显示:石杉碱甲对血管痴呆大鼠海马区神经元有一定的改善作用；与模型组比较，石杉碱甲组大鼠海马GDNFmRNA表达明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05)。结论 石杉碱甲可显著改善血管性痴呆大鼠的学习记忆障碍，其机制可能与石杉碱甲能增强脑组织SOD活性，降低胆碱酯酶活性，减少MDA和NO含量，从而提高了脑组织的抗氧化水平，发挥其神经保护作用有关。

石杉碱甲；血管性痴呆；胶质细胞源性神经营养因子

血管性痴呆(vascular dementia,VD)是由于各种脑血管病引起脑功能障碍而产生的智能损害性疾病,痴呆为主要临床表现。随着社会老龄化加重,血管性痴呆作为我国老年人的常见病和多发病［1］,其发病率呈上升趋势,占我国老年痴呆病60%左右。研究表明［2-3］,石杉碱甲(huperzine A)具有保护脑组织,免受自由基损伤,发挥抗衰老的作用。为深入探讨其作用机制,本文采用大脑中动脉永久性缺血的血管性痴呆大鼠模型,旨在探讨石杉碱甲对VD模型大鼠学习和记忆能力的影响。

1 材料与方法

1.1 动物 健康SD雄性大鼠36只,体质量180～220 g,试验前适应性饲养1周,由白求恩医大实验动物中心提供,合格证号2011-004,自由进食进水,12 h光照/黑暗周期,环境温度(22±1)℃,所使用的动物遵循国家《实验动物保护条例》。

1.2 药物试剂与仪器 石杉碱甲片(上海复旦复华药业有限公司,批号:H10960133),GDNF原位杂交检测试剂盒(博士德生物工程有限公司)。考马斯亮兰蛋白测定试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒、丙二醛(MDA)测定试剂盒、NO测定试剂盒、乙酰胆碱酯酶活性检测试剂盒,均由南京建成生物工程研究所提供。Morris水迷宫由中国医学科学院治疗所生产。FA1004型电子天平(上海天平仪器厂)。LD5.2A型超速离心机(北京医用离心机厂)。

1.3 模型制作 参照田金洲［4］制作大脑中动脉永久性缺血动物模型。用2%的戊巴比妥钠(40 mg/kg,ip)将大鼠麻醉,固定后常规消毒,取颈部切口,钝性分离出右侧颈总动脉(CCA)、颈内动脉(ICA)及颈外动脉(ECA),永久结扎同侧颈总动脉,将CCA的ECA与ICA分叉处剪一小口并迅速沿ICA顺行插入栓线,推进大脑中动脉(MCA)至17～20mm时停止推送,达到大脑中动脉阻塞导致脑缺血目的。动物模型纳入标准:动物麻醉清醒后出现对侧前肢倦曲或行走转圈体征,动物无以上体征或2 h后仍不清醒者剔除［5］。

1.4 分组与给药 选择36只合格大鼠,随机均分为正常组和模型组、石杉碱甲组,每组12只。模型组、石杉碱甲组采用大脑中动脉永久性缺血模型,造模后7 d开始灌胃给药,其中石杉碱甲组给予石杉碱甲片混悬液0.1mg/(kg·d),ig,连续给药30 d;正常对照组和模型组给予等容量蒸馏水。

1.5 大鼠行为学检测 治疗前后Morris水迷宫检测每组大鼠学习和记忆能力。①定位航行试验:经历5 d,每日上、下午分别测试1次,将大鼠分别从4个不同象限放入水中,记录大鼠在2min内找到平台的时间(即为逃避潜伏期);在2 min内未能找到平台,潜伏期记录为120 s。通过定位航行试验观察大鼠逃避潜伏期的长短检测其学习能力;②空间探索试验:第6天拆除平台,将大鼠从任意一点放入水中,观察大鼠2 min内在池中的游泳轨迹,记录大鼠穿越平台的次数。

1.6 生化指标检测 行为学测试结束24 h后,给予动物4%多聚甲醛灌注20min。断头取各组大鼠脑组织,从下丘脑中部切为2部分,前半部分在冰浴下用匀浆器匀浆,用生理盐水制成10%的组织匀浆,4℃3000 r/min离心10min,取上清液检测。按照试剂盒说明,检测脑组织SOD和胆碱酯酶活性及MDA和NO含量。

1.7 形态学检查 后半部脑组织放入10%甲醛溶液中固定。亚甲蓝染色,对海马区进行组织形态学观察。

1.8 原位杂交法测定大鼠海马GDNFmRNA 参照GDNF原位杂交检测试剂盒说明书进行,切片经二甲苯脱蜡,酒精水化,滴加5μg/mL胃蛋白酶,37℃孵育25min来灭活内源性酶。加入20μL预杂交液,静置2 h,滴入杂交液20μL后孵化18 h;加入生物素化鼠抗地高辛标记DNA探针,然后滴加显色液,37℃生物素化过氧化物酶30min,常规脱水、透明及封片。用PBS代替探针作阴性对照。用Image-ProPlus图像分析软件对GDNF mRNA结果分析,各组切片取8个不同视野测定积分吸光度,吸光度值越大表示阳性产物表达越强,取平均值代表GDNFmRNA表达强度。

1.9 统计学方法 所有数据采用SPSS 15.0统计学软件包进行处理,正态计量资料以“±s”表示,组间比较采用配对t检验;计数资料组间率的比较采用χ2检验,以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 石杉碱甲对血管性痴呆大鼠行为学的影响 模型组大鼠逃避潜伏期延长并且跨越平台次数减少,与正常组比较,差异有统计学意义(P＜0.05);治疗后石杉碱甲组逃避潜伏期显著缩短且跨越平台次数增加,与模型组比较,差异具有统计学意义(P＜0.05)。提示石杉碱甲具有改善VD模型大鼠学习记忆能力的作用(见表1)。

表1 石杉碱甲对血管性痴呆大鼠行为学的影响Tab.1 Effect of huperzine A on VD rats

2.2 石杉碱甲对血管痴呆大鼠脑组织病理形态学的影响

正常组大鼠海马区细胞数目多,边界整齐,神经元胞体中核大而圆,核仁清楚。模型组大鼠海马区细胞稀疏,尼氏体消失,核深染固缩,有些神经元旁边出现空染区。石杉碱甲组大鼠海马区正常神经元数目较多,排列比较整齐,但少量细胞出现核内染色质浓缩见图1。

图1 3组大鼠形态学染色结果(×400)Fig.1 Morphology staining results of ras in three group(×400)

2.3 石杉碱甲对血管性痴呆大鼠脑组织氧化应激水平的影响 与正常组比较,模型组大鼠脑组织SOD活性明显下降,胆碱酯酶活性升高,MDA和NO含量明显增加;与模型组比较,石杉碱甲组可以升高血管痴呆大鼠脑组织SOD活性,降低胆碱酯酶活性,减少MDA和NO含量,差异均有统计学意义(P＜0.05,见表2)。

表2 石杉碱甲对血管性痴呆大鼠脑组织氧化应激水平的影响Tab.2 Effect of huperzine A on oxidative stress level in VD rats

2.4 石杉碱甲对大鼠海马GDNFmRNA的影响 与正常组大鼠比较,模型组大鼠海马GDNFmRNA表达降低明显,差异有统计学意义(P＜0.05);与模型组比较,石杉碱甲组大鼠海马GDNFmRNA表达提升,差异有统计学意义(P＜0.05,见表3、图 2)。

表3 原位杂交法测定各组大鼠海马GDNFmRNA比较Tab.3 Comparison of GDNFmRNA in hippocampal by situ hybridization

图2 原位杂交各组GDNFmRNA的表达(×400)Fig.2 Expression of GDNFmRNA by situ hybridization in groups(×400)

3 讨论

石杉碱甲是从草药千层塔中分离得到的一种新型石松类生物碱［6-7］,是一种高效可逆的胆碱酯酶抑制剂,脂溶性较高,分子量小,易透过血脑屏障,进入中枢后分布于大脑颞叶、海马等部位,能增加突触间隙内乙酰胆碱含量,弥补乙酰胆碱神经递质的缺损。此药具有抗氧自由基,保护大脑缺氧、缺血损伤,增强学习记忆的作用［8］。且作用时间长,反复给药没有依赖性,较大剂量给药也无明显的肝毒性［9］。水迷宫结果显示,VD模型组大鼠学习记忆能力显著下降,而给予石杉碱甲后逃避潜伏期明显缩短而且跨越平台次数增加,提示石杉碱甲对VD大鼠学习记忆能力减退有一定的预防和改善作用。

本实验采用大脑中动脉永久性缺血制备VD模型,模型组出现学习、记忆损害,而无明显的运动障碍,其海马组织学切片显示神经元凋亡。此造模方法简单,重复性较好,动物死亡率低,能较好地模拟人类VD的发生［10］。

自由基介导的脂质氧化和过氧化反应在中枢神经系统疾病如脑卒中、神经退行性病变等疾病起到重要的作用［11］。SOD是一种金属蛋白酶,能清除超氧阴离子自由基、抑制脂质过氧化的作用,提高体内SOD含量,从而保护细胞免受自由基的伤害。MDA是不饱和脂肪酸产生脂质过氧化反应的代谢产物,测定MDA含量变化可反应机体自由基损伤的程度［12］。因此SOD活性和MDA含量的变化可直接评价脑组织损伤程度和药物疗效。

NO是一种具有重要生物活性的信号分子,具有调节脑血流、促进或抑制神经递质释放、参与突触可塑性等多种作用,且与学习和记忆有关［13］。脑组织是对缺血缺氧最敏感的部位,当脑缺血缺氧时,离子泵功能障碍并释放兴奋性氨基酸,大量Ca2+内流,NOS的持续性激活和释放,导致NO含量的升高［14］。NO是神经活性物质,在血管痴呆中有重要作用。乙酰胆碱是形成记忆的神经递质,它由胆碱乙酰转移酶(ChAT)合成,胆碱酯酶(AchE)分解。大脑缺血后中枢胆碱能神经元受损,突触数量减少导致ACh递质减少。因此减弱乙酰胆碱酯酶(AChE)活性,有助于改善血管性痴呆的记忆障碍。

GDNF在脑缺血后神经元损伤的修复以及认知功能的恢复中都有重要作用［15］。本实验结果表明:大鼠在慢性脑缺血后GDNF表达下降,石杉碱甲治疗后表达增高,能减轻损伤程度并促进后期神经功能的恢复,石杉碱甲可以使血管痴呆大鼠脑组织SOD活性升高,胆碱酯酶活性下降,MDA含量和NO含量减少。石杉碱甲对血管痴呆大鼠脑组织海马区神经元形态变化有一定的改善。说明石杉碱甲能够抗氧化、清除自由基,对血管性痴呆大鼠神经系统恢复有重要作用。

综上所述,石杉碱甲可显著改善血管性痴呆大鼠的学习记忆障碍［16-17］,其机制可能与石杉碱甲能增强脑组织SOD活性、降低胆碱酯酶活性、减少MDA和NO含量,从而提高脑组织的抗氧化水平,发挥其神经保护作用有关。

［1］ 何金波，金杰.参芎葡萄糖注射液治疗血管性痴呆的疗效及对AVP的影响［J］.中国实验方剂学杂志，2012，18（21):306.

［2］ 姜立群，张守字.石杉碱甲联合美金刚治疗老年性痴呆的临床观察［J］.中国医院用药评价与分析，2009，9（6):465-466.

［3］ 杜井波，翁秋霖，陈小虎，等.石杉碱甲对不同严重程度血管性痴呆患者的疗效分析［J］.中国临床神经科学，2011，19（5):510-514.

［4］ 田金洲.血管性痴呆［M］.北京:人民卫生出版社，2003:598.

［5］ 邢兆宏，张秋霞，赵晖，等.补阳还五汤与六味地黄丸合方对脑缺血大鼠APP蛋白及突触重构的影响［J］.中国实验方剂学杂志，2012，18（20):161.

［6］ 王怀荟，刘万卉，孙雯.石杉碱甲治疗阿尔茨海默病的临床研究现状［J］.中国新药杂志，2011，20（11):993-998.

［7］ 徐阜溧.石杉碱甲配合针刺治疗脑梗死后血管性痴呆观察及护理［J］.实用中医药杂志，2012，28（1):32-33.

［8］ Adibhatla RM，Dempsy R，Hatcher JF.Integration of cytokine biology and lipid metabolism in stroke［J］.Front Biosci，2008，13 （1):1250-1270.

［9］ 张晓雅，张英强.脑力苏方对血管性痴呆小鼠脑组织SOD和MDA含量的影响［J］.成都中医药大学学报，2011，34（1):52-54.

［10］ 展淑琴，高亚亚，张凌峰，等.大鼠大脑中动脉永久性缺血和缺血再灌注模型的比较［J］.陕西医学杂志，2013，42（6):643-646.

［11］ TD Moody，HJCarlisle，TJO'Dell.A Nitric Oxide-Independentand β-Adrenergic Receptor-Sensitive Form of Metaplasticity Limitsθ-Frequency Stimulation-Induced LTP in the Hippocampal CA1 Region［J］.Learning&Memory，1999，6（6):619-633.

［12］ 任蕾，杜井波，翁秋霖，等.不同剂量石杉碱甲对血管性痴呆患者的疗效评价［J］.中国临床神经科学，2010，18（6):644-646.

［13］ 张哲君.石杉碱甲联合尼莫同治疗老年性痴呆的临床观察［J］.中国现代医生，2007，45（13):23-24.

［14］ 徐小花，许之驹，黄惠剑.石杉碱甲治疗40例阿尔茨海默病患者的疗效分析［J］.中国民康医学，2008，20（9):904-905.

［15］ Miyazaki H，Nagashima K，Okuma Y，et al.Expression of glial cell line-derived neurotrophic factor induced by transient forebrain ischemia in rats［J］.Brain Res，2001，922（2):165-172.

［16］ 肖迎春，刘楠，周宜灿，等.石杉碱甲联合来士普对血管性痴呆患者的疗效观察［J］.光明中医，2013，28（3):580-582.

［17］ 刘进进.丁咯地尔与石杉碱甲联用治疗老年血管性痴呆的疗效［J］.中国老年学杂志，2012，32（8):1677-1678.

(编校:吴茜)

Effect of huperzine A on glial cell line derived neurotrophic factor expression and oxidative stress level in vascular dementia rat

LIU Zhong-jin1,ZHANG Hai-yan2,LIU Jia-jun1Δ,LIU Zi-hui1

(1.Department of Neurology,First Affiliated Hospital of Qiqihar Medical College,Qiqihar 161006,China;
2.Department of Histology and Embryology,Qiqihar Medical College,Qiqihar 161006,China)

Objective To observe the effect of huperzine A on glial cell line derived neurotrophic factor(GDNF)expression and oxidative stress level in vascular dementia rat.Methods 36 male SD rats were random ly divided into three groups:normal group,model group and huperzine A group,each group had 12 rats.Permanentmiddle cerebralartery ischemiamodelwere established with rats inmodelgroup and huperzine A group.7 days latter,rats of huperzine A group were given gastric perfusion huperzine A 0.1mg/(kg·d),ig,once a day for 30 days.The normal control group and model group ratswere given equal volume of distilled water.Animal's behavior,related biochemical indicators and AChE and SOD activity level in all groups were observed,MDA and NO contents in the brain were determined.The changes of pathomorphology were observed by HE staining.The expression of GDNFmRNA were tested by situ hybridization.Results Huperzine A could shorten the reaction time of learning,prolong the latent time ofmemory,reduce times ofmistakes,raise the SOD activity of brain tissue,decrease MDA and NO content,restrain the activity of AChE(P＜0.05).The pathology results showed that therewas an improvement in the pathological changes of cortex and hippocampus of vascular dementia rats brain tissue.Compared with themodel group,the expression of rats'hippocampus GDNF mRNA in huperzine A group was obviously improved,the difference was statistically significant(P＜0.05).Conclusion Huperzine A can significantly improve the vascular dementia rats learning and memory impairment,itsmechanism may be related to that huperzine A can enhance brain tissue SOD activity and reduce the cholinesterase activity,reduce the content of MDA and NO,thus improve the antioxidant levels of brain tissue,exert its nerve protective effect.

huperzine A;vascular dementia;glial cell line derived neurotrophic factor

R739

A

1005-1678（2014)06-0044-04

齐齐哈尔市科学技术计划项目(SFZD-2013111)

刘忠锦，男，硕士，主治医师，研究方向：中西医结合防治老年痴呆，E-mail：23741166@qq.com；刘佳俊，通信作者，男，硕士，副主任医师，研究方向：中西医结合防治老年痴呆，E-mail：13946231606@163.com。