万里,郑旭琴

(1.湖北省武汉市第三医院光谷院区 普外科,湖北 武汉 430073;2.南京医科大学 临床医学系,江苏 南京 210029)

SATB1在甲状腺癌中的表达及促进甲状腺癌侵袭能力的实验研究

万里1,郑旭琴2

(1.湖北省武汉市第三医院光谷院区 普外科,湖北 武汉 430073;2.南京医科大学 临床医学系,江苏 南京 210029)

目的 研究富含AT序列的特异结合蛋白1（special AT rich sequence binding protein 1，SATB1)对甲状腺癌细胞侵袭转移的影响，探讨SATB1促进甲状腺癌侵袭转移的分子机制。方法 构建针对SATB1基因的过表达质粒，转染甲状腺癌SW-579细胞，qRT-PCR和Western blotting方法测定转染效率及上皮细胞标志蛋白E-钙粘素（E-cadherin)和间质细胞标志蛋白波形蛋白（vimentin)的表达变化；qRT-PCR进一步检测转录因子Twist1和Snail1，基质金属蛋白酶MMP2和MMP9，以及炎性因子IL-6和IL-8的表达变化；倒置显微镜观察细胞形态改变；细胞创伤愈合实验及Transwell方法检测过表达SATB1后甲状腺癌细胞迁移、侵袭能力变化。Western blotting检测SATB1增强表达后Akt磷酸化表达变化，PI3K/Akt通路抑制剂LY294002处理细胞后观察过表达SATB1的SW579细胞迁移侵袭能力变化。结果 细胞迁移实验结果显示，过表达SATB1后每个视野下迁移细胞数（196±10)个，较对照组（107±12)个明显增加（P＜0.01)；侵袭实验结果显示，过表达SATB1后穿过基质胶的细胞数（158±12)个，较对照组（86±15)个明显增加（P＜0.01)。Western blotting结果显示转染SATB1后，在总Akt蛋白无改变的情况下，SW-579细胞磷酸化Akt（p-Akt)明显增加。而通过加入PI3K/Akt通路抑制剂LY294002后，细胞迁移及侵袭能力明显减弱。结论 SATB1与甲状腺癌侵袭转移有关；其高表达具有促进甲状腺癌细胞上皮细胞间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT)的作用；PI3K/Akt信号通路可能参与了SATB1的促转移过程。

甲状腺癌；SATB1；转移；PI3K/Akt

随着对SATB1研究的深入,研究者发现SATB1不仅调节众多与肿瘤相关的基因,而且参与调节多条与肿瘤生长、分化及转移相关的重要分子通路［1-2］。俨然成了肿瘤细胞交通的重要信号灯。然而,生物体不同的器官、组织乃至不同的细胞间,分子基因的表达及信号通路可能存在差异［3］。SATB1在甲状腺癌中的作用及相关机制目前未有研究报道。本部分实验通过检测转染SATB1的SW-579细胞及空载体细胞中PI3K/Akt通路重要的信号分子Akt磷酸化程度的改变,研究此通路的活化程度。同时通过加入PI3K/Akt通路抑制剂LY294002观察SW-579细胞迁移侵袭能力的改变以及与转移相关的重要分子的变化。探讨SATB1调节甲状腺癌细胞转移的分子机制,以补充对SATB1在甲状腺癌转移过程的认识。

1 材料和方法

1.1 细胞株 转染了人SATB1过表达质粒的SW-579细胞及转染了空载体的SW-579细胞用15%新生牛血清的DMEM培养基培养。细胞置于与5%CO2培养箱中培养,每3天传代一次。在做LY294002抑制实验时,将相同数量的细胞种于6孔板中,提前1天对细胞进行饥饿处理。

1.2 LY294002抑制实验 相同数量的转染SATB1过表达质粒的SW-597细胞分别种于2个6孔板中,实验前12 h将培养基换成无血清培养基进行饥饿处理,以降低细胞增殖的影响。查阅文献后［2］,1孔细胞以10 umol/L浓度的LY294002处理,另1孔细胞加入相同体积的PBS。12h后弃去培养基,消化细胞后制成细胞悬液,进行细胞迁移和侵袭实验。

1.3 Western blotting实验检测p-Akt与Akt 提取处于对数生长期的细胞,滴管吸弃培养液,PBS冲洗3次,甩干液体后加400 uL的含PMSF的RIPA裂解液,冰上裂解30min,期间注意多次反复吹打,细胞刮刮下细胞后用移液器将裂解液转移至EP管内。4℃12000 g离心15min。移液器小心吸取上清液,取一部分按下面的步骤测蛋白浓度,剩下的蛋白与2×SDS加样缓冲液按1∶1体积混合,放入1.5 mL EP管中在水浴锅内100℃煮10 min,于冰上冷却后分装,-80℃保存。用分光光度计测蛋白浓度;用自来水冲洗干净制胶玻璃板后放于烤箱烤干后按要求安装,为了避免漏胶,配制封底胶。将凝胶垂直置于室温下20min。取出变性的蛋白质样本,上样量为30 ug,在加样孔的外周孔加1×SDS凝胶加样缓冲液以平衡。将电泳装置接通电源,设置电源加压量为60 V,当溴酚蓝指示剂前沿进入分离胶后,电压可提高到90～120 V,继续电泳直至溴酚蓝指示剂到达分离胶底部(约2.5 h),关闭电源。

2 结果

2.1 SATB1在甲状腺癌细胞EMT中的作用

2.1.1 SATB1稳定转染效率测定:SATB1过表达质粒转染SW-579细胞筛选培养后,收获细胞,提取RNA及蛋白后,qRTPCR方法和Western blotting方法检测SATB1在RNA及蛋白水平上转染效率。结果发现:转染SATB1后,过表达细胞较空载体对照组SATB1 RNA及蛋白水平表达均明显增加,其中RNA水平增加55倍(P＜0.001)。证实转染有效。

2.1.2 过表达SATB1对甲状腺癌细胞形态的影响:在普通倒置显微镜下观测转染SATB1基因后SW-579细胞形态改变,可见上皮样的SW-579细胞由连接紧密的类圆形变成连接松散的狭长形,细胞间连接减少(见图1)。

图1 转染SATB1后,SW-597细胞形态改变Fig.1 SW-597 cellmorphological change after transfection SATB1

2.1.3 过表达SATB1对甲状腺癌细胞标志分子的影响:上皮标志蛋白E-cadherin和间质标志蛋白Vimentin是上皮间质转化的重要分子,通过 qRT-PCR检测到过表达 SATB1后,E-cadherin表达减少(71.20±0.65)%(P＜0.05),Vimentin表达增加(4.30±0.73)倍(P＜0.05),Western blotting结果与之一致。同时,与EMT相关的转录因子Snail1、Twist1分别增加(3.90±0.21)、(2.30±0.18)倍(P＜0.05)。

2.1.4 过表达SATB1对甲状腺癌肿瘤微环境相关因子的影响:金属蛋白酶MMPs及炎性因子是促肿瘤转移微环境非常重要的因素,通过qRT-PCR结果,发现过表达SATB1后MMP2、MMP9 RNA表达水平分别增加(3.90±0.23)、(2.50±0.10)倍,IL-6、IL-8 RNA表达水平分别增加(1.90±0.09)、(1.50±0.06)倍。

2.1.5 过表达SATB1对甲状腺癌细胞迁移、侵袭能力的影响:细胞创伤愈合实验结果显示:过表达SATB1的SW-597细胞24h愈合率约84%,而空质粒对照细胞愈合率约为52%,提示转染SATB1后能明显增加SW-597细胞的迁移能力。Transwell结果也显示,过表达SATB1后SW-579细胞迁移侵袭能力明显增加,过表达SATB1的SW-597细胞与空质粒组SW-597细胞迁移数分别为(196±10)个、(107±12)个(n=5,P＜0.01)。侵袭细胞数分别为(158±12)个、(86±15)个(n=5,P＜0.01)。

2.2 SATB1调节甲状腺癌细胞侵袭转移的分子机制

2.2.1 过表达SATB1对PI3K/Akt信号通路的影响:转染SATB1质粒后提取细胞蛋白,用Western blotting方法检测p-Akt及总Akt蛋白表达水平发现,增加SATB1表达后,与空载体细胞相比,总Akt蛋白量不变,而磷酸化Akt(p-Akt)表达明显增加(见图2)。

图2 SATB1对Akt磷酸化的影响Fig.2 Effect of SATB1 on Akt phosphorylation

2.2.2 抑制PI3K/Akt信号通路对SATB1促甲状腺癌细胞侵袭能力的影响:转染了SATB1的SW-579细胞按一定数量种于6孔板中,提前12h给予饥饿处理。实验组给予10 umol/L LY294002处理,对照组给予相同体积PBS处理。12h后通过transwell小室检测细胞迁移和侵袭能力改变。结果显示,迁移实验中,实验组穿过小室的细胞与对照组分别为(156±12)个、(198±9)个(P＜0.05);侵袭实验中,实验组穿过小室的细胞与对照组分别为(103±13)个、(146±15)个(P＜0.05,见图3)。

图3 LY294002对SATB1促进的SW-597细胞迁移(A)、侵袭(B)的影响Fig.3 Effect of LY294002 onmigration(A)and invasiveness(B)of SW-597 Cell promoted by SATB1

3 讨论

肿瘤的发生发展涉及到多条信号通路的调节,Tamburrino A发现在原发性甲状腺髓样细胞癌特别是当伴有淋巴结转移时,Akt/mTOR活化明显增加［5］。而Uddin S等人也发现,Leptin-R可通过PI3K/Akt信号通路促进甲状腺癌进展［6］。Kim CS研究小组通过甲状腺癌小鼠模型证实了cAMP/PKA和MAPK信号通路的重要性,他们还发现,PI3K/Akt通路和(或)促甲状腺激素调节的信号通路的过度激活可诱发甲状腺癌的发生及促进转移［7-8］。

SATB1可上调金属蛋白酶MMP2、MMP9以及炎性因子IL-6与IL-8的表达。PI3Ks信号参与细胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖转运等多种细胞功能的调节,近年发现PI3K/Akt信号轴与人类肿瘤的发生发展关系密切［9-13］。本实验通过Western blotting方法检测转染SATB1后磷酸化Akt(p-Akt)表达增多,而总Akt无明显变化,提示SATB1可激活PI3K/Akt信号通路。为了进一步证实这个现象。通过通路抑制剂LY294002阻断PI3K/Akt通路后,观察到甲状腺癌细胞迁移侵袭能力减弱。提示PI3K/Akt信号通路可能参与了SATB1对甲状腺癌转移的分子过程。然而,仅通过体外实验初步发现甲状腺癌中SATB1可能与PI3K/Akt通路有关,它们之间的具体作用关系有待进一步验证。Chen Bo等人证实Akt可以磷酸化SATB1的丝氨酸47位点,进而避免SATB1解离［14］。结合实验结果,推测 SATB1与 PI3K/Akt信号通路间存在一个调节环路,2者相互影响。一方面,SATB1可通过激活PI3K/Akt信号通路来调节甲状腺癌细胞迁移侵袭,另一方面,PI3K/Akt通路分子可磷酸化方式维持SATB1的正常形式,从而避免 SATB1被体内 caspase-3等水解酶降解,影响SATB1对下游基因的调控(见图4)。

图4 SATB1与PI3K/Akt通路之间可能的作用关系示意图Fig.4 Interaction between SATB1 and PI3K/Akt pathway

综上所述,本研究认为PI3K/Akt信号通路参与了SATB1对甲状腺癌细胞侵袭转移的调节过程,然而这2者之间可能存在更为复杂的关系,有待进一步研究。此外,Wnt信号通路在SATB1对T细胞的调节过程中起到重要作用,故是否存在其它的信号通路参与了SATB1对甲状腺癌侵袭转移过程,需要更深入的研究。

［1］ 龚龙，孙圣荣，易春华，等.特异性核基质结合区结合蛋白-1在甲状腺癌中的表达及促进甲状腺癌侵袭能力的研究［J］.中华实验外科杂志，2013，30（5):937-939.

［2］ 郑时玉，王丽，刘泽兵，等.慢病毒介导的c-met RNA干扰对人乳头状甲状腺癌K1细胞生物学行为的影响［J］.中国病理生理杂志，2012，28（10):1819-1824.

［3］ 黄伟，吴高松，陈华涛，等.他莫昔芬联合全反式维甲酸体外干预人分化型甲状腺癌的研究［J］.中华实验外科杂志，2012，29（10):1977-1980.

［4］ 王娟，俞力，范钰，等.miR-155反义寡核苷酸转染对甲状腺癌细胞迁移、侵袭和MMP-13表达的影响［J］.江苏大学学报（医学版)，2013，23（6):526-528.

［5］ 丁政，樊友本，邓先兆，等.靶向干扰叉头框 E1基因对甲状腺癌细胞上皮间质转化的影响［J］.中华内分泌外科杂志，2014，（2):141-144.

［6］ 施丹丽，王和贤.姜黄素对甲状腺癌细胞增殖与迁移能力的影响［J］.海南医学，2013，24（20):2970-2972.

［7］ 孙建娟，刘纯，孙珂，等.整合素β4表达对甲状腺滤泡癌转移潜能的意义［J］.中华内分泌代谢杂志，2010，26（10):850-853.

［8］ 孙团起，吴毅.局部进展甲状腺癌的外科处理［J］.外科理论与实践，2012，17（1):11-14.

［9］ 高明，李小龙，于洋，等.甲状腺癌的临床病理及PET-CT的诊断价值［J］.中华耳鼻咽喉头颈外科杂志，2006，41（6):419-424.

［10］郁海燕，张进安，张利华，等.下调 CXCR4基因对甲状腺癌细胞SW579增殖和侵袭能力的影响［J］.山西医科大学学报，2010，41（11):942-946.

［11］李小龙，高明，郑向前，等.甲状腺乳头状微小癌的临床生物学特性研究［J］.中国肿瘤临床，2008，35（23):1325-1327.

［12］王焱.MicroRNAs在未分化甲状腺癌侵袭转移中的调控作用［J］.现代诊断与治疗，2011，22（2):82-85.

［13］王波，赵文新.STAT3-siRNA对人甲状腺癌SW579细胞株增殖侵袭的影响［J］.中国实用医药，2010，5（13):1-4.

［14］吴勇军，唐仪，冯德云，等.CD151对甲状腺癌细胞迁移及侵袭能力的影响［J］.现代生物医学进展，2011，11（11):2071-2074.

［15］王莎莎，林岩松，梁军，等.BRAF基因突变及其对分化型甲状腺癌钠碘同向转运体功能影响的研究进展［J］.中华肿瘤防治杂志，2011，18（18):1497-1500.

(编校:谭玲)

Expression pattern and function of SATB1 in the invasiveness of thyroid carcimoma

WAN Li1,ZHENG Xu-qin2

(1.Department of General Surgery,Optical Valley of The Third Hospital ofWuhan City,Wuhan 430073,China;2.Clinical Medicine,Nanjing Medical University,Nanjing 210029,China)

Objective To study the effect of SATB1 on invasiveness and metastasis of thyroid carcinoma cells,and to explore its molecular mechanisms to promote invasion and metastasis in thyroid carcinoma.Methods Construction of over expression plasmid for SATB1 gene,transfection of thyroid carcinoma SW-579 cells,transfection efficiency and epithelial cellmarker protein of E-cadherin and Western blottingmethod for determination of qRT-PCR(E-cadherin)and mesenchymal cellmarker vimentin(Vimentin)expression;qRT-PCR further detection of transcription factor Twist1 and Snail1,matrix metalloproteinases MMP2 and MMP9,as well as the the expression of inflammatory factors IL-6 and IL-8 changes;cellmorphology was observed under an inverted microscope;cellwound healing assay and Transwell were used to detect the expression of SATB1 after thyroid cancer cell migration,invasion ability changes.Western blotting for detection of SATB1 enhanced the expression changes of Akt phosphorylation,PI3K/Akt pathway inhibitor LY294002 cellswas observed after overexpression of SATB1 in SW579 cellmigration and invasion ability changes.Results The experimental results showed that cellmigration,over expression of SATB1 after each perspective transfer cells(196±10),compared with the control group(107±12),had a significantly increased(P＜0.01);invasion and experimental results showd that,after overexpression of SATB1 through the Matrigel cell number(158±12),compared with the control group(86±15),which significantly increased(P＜0.01).Western blotting found that after the transfection of SATB1 in total Akt protein,no change of circumstances,SW-579 cells,the phosphorylation of Akt(p-Akt)increased significantly.But suppressed by PI3K/Akt signaling pathway inhibitor LY294002,observed cellmigration and invasion ability decreased significantly.Conclusion SATB1 is associated with invasion and metastasis of thyroid carcinoma;its high expression is the promotion of thyroid carcinoma cell EMT in vitro;PI3K/Akt signaling pathwaymay be involved in promoting the transfer process of SATB1.Further confirmation and molecular SATB1 inmetastatic thyroid cancer cellsin themechanism of action in vivo test,may provide the experimental basis for potential intervention targets for inhibition ofmetastasis of thyroid cancer.

thyroid carcinoma;SATB1;metastasis;PI3K/Akt

R736

A

1005-1678（2014)06-0018-04

国家自然科学基金(81102032)

万里，男，本科，主治医师，研究方向：普外科，E-mail：qch1821460024@163.com。