李淑梅 黄章敏 陈良龙

基础研究

阿托伐他汀对冠状动脉微栓塞后心肌炎症的影响

李淑梅 黄章敏 陈良龙

目的探讨阿托伐他汀干预治疗对冠状动脉微栓塞（CME）后心肌炎症的影响。方法48只清洁级雄性SD大鼠经左心室内注射自体微血栓，同时短暂夹闭主动脉，建立大鼠CME模型后，随机分为未治疗组及阿托伐他汀（Atrovastatin）干预组，于术后7 d处死。HE染色观察梗死心肌，免疫组织化学染色及Western blot检测肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白介素6（IL-6）及细胞间黏附因子1（ICAM-1）等炎症因子在心肌中表达的变化。结果阿托伐他汀可轻度减少梗死面积，显著抑制CME后心肌中白细胞浸润及TNF-α、IL-6、ICAM-1蛋白表达（P均＜0.05）。结论阿托伐他汀能显著抑制CME后心肌炎症反应。

冠脉微栓塞； 肿瘤坏死因子α； 白介素6； 细胞间黏附因子1； 他汀

冠脉微栓塞（CME）在缺血性心脏病、急性冠脉综合征（ACS）、溶栓治疗、冠脉介入治疗（PCI）中是常见而重要的临床事件[1]。众多的临床资料及试验研究显示，炎症反应在CME病变中占重要位置。对极大可能发生CME的不稳定型心绞痛和ACS患者观察发现，其血清C反应蛋白（CRP）、白介素6（IL-6）明显升高[2，3]；CME 病理上呈现白细胞浸润、多中心微梗灶形成等炎症反应特征。CME炎症反应不仅局限微梗塞区，同时累及许多“正常”心肌。Skyschally等[4]提出抗炎治疗有望成为CME的治疗策略。研究表明，他汀类药物可有效减轻全身及心血管炎症[5]。本研究应用免疫组化、蛋白质印迹分析等方法，观察阿托伐他汀对CME伴发心肌炎症的影响，为预防缺血性心脏病的发生寻找有效干预措施提供新依据。

1 材料和方法

1．1 实验动物和主要试剂 清洁级雄性SD大鼠，体质量280～320 g，由福建医科大学实验动物中心提供。羊抗大鼠肿瘤坏死因子α（TNF-α）抗体购自Santa Cruz公司（美国），羊抗大鼠白细胞介素-6（IL-6）、细胞间黏附因子-1（ICAM-1）抗体购自R&D公司（美国），原位杂交试剂盒、SP免疫组化试剂盒、AEC染色试剂盒、BCIP/NBT显色试剂盒均购自北京中山生物技术有限公司。阿托伐他汀（Atrovastatin）由辉瑞制药公司提供。

1．2 动物分组及模型建立[6]SD大鼠48只，分为CME组（24只）和CME+Atrovastatin治疗组（24只）。CME组以5 mg微血栓中加入0.3 ml PBS后剧烈震荡制成混悬液左心室腔内注射造模；Atrovastatin治疗组在CME组的基础上，阿托伐他汀20 mg/kg灌胃给药。于术后第7天处死大鼠，将心脏常规液氮保存。

1．3 微梗死面积及白细胞记数 取乳头肌段心室肌，10%甲醛固定，石蜡包埋，标本按3μm厚度系列切片，每标本切6张。行心肌HE染色，相差显微镜下通过图像处理软件计算心肌梗死面积占总面积的比值；每个切面随机选取10个视野（73 800μm2）记数浸润的白细胞。

1．4 免疫组织化学染色检测TNF-α、IL-6、ICAM-1等炎症因子在心肌中的表达 采用SP-ABC法，具体步骤是：染色切片常规脱蜡至水，0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲液微波抗原修复，3%H2O2去离子水抗内源性过氧化物酶，加入血清，室温封闭20 min，山羊抗大鼠 TNF-α、IL-6、ICAM-1（1∶200 稀释）抗体置湿盒4℃过夜；依次加入生物素标记的二抗及链霉亲和素-过氧化物酶溶液，室温10 min，AEC显色，苏木素轻度复染。显微镜观察胞质内出现红色颗粒的细胞为TNF-α、IL-6、ICAM-1阳性表达细胞。用Image-ProPlus图像分析系统进行图片处理，随机选取每张切片20个视野，测定其阳性染色的平均光密度值（IOD）。IOD值越高表明组织抗原含量越高；20个视野的平均值作为该切片的IOD值。

1．5 Western blot检测心肌组织 TNF-α、IL-6、ICAM-1蛋白表达 取100 mg心肌组织，采用蛋白提取试剂盒按说明书提取胞浆蛋白，以牛血清白蛋白作标准曲线，Bradford法测定蛋白浓度。样品蛋白与加样缓冲液等体积混匀，每份样品上样总蛋白50μg。8%分离胶，5%浓缩胶，SDS-PAGE凝胶恒压电泳。电泳结束后，应用半干电转仪将蛋白转移到NC膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h，加入1∶500稀释的一抗于4℃孵育过夜。TBS洗涤后加入辣根过氧化物酶标记相应二抗及内参HRP-GAPDH 37℃孵育1 h。TBS洗涤后应用化学发光法显色，用GSD8000密度扫描分析系统（英国UVP公司）进行图像分析，以TNF-α、IL-6、ICAM-1与GAPDH条带的吸光面积积分比值IOD评定其蛋白表达水平。

1．6 统计学方法 采用SPSS 13.0统计软件进行分析。结果以±s表示，多组间比较采用one-way ANOVA分析和Dunnett-t检验。检验水平（α）为0.05。

2 结果

2.1 阿托伐他汀对微梗死面积及白细胞心肌浸润的影响 阿托伐他汀可轻度减少微梗死面积，显著降低白细胞浸润（P＜0.01）。见表1。

表1 阿托伐他汀对微梗死面积及白细胞心肌浸润的影响（±s）

表1 阿托伐他汀对微梗死面积及白细胞心肌浸润的影响（±s）

注：与 CME 组比较，aP＜0.05，bP＜0.01

组别 梗死面积 WBC（/mm2）CME 组 16.29±2.13 755±106 Atrovastatin 组 14.38±1.64a 389±79b

2.2 阿托伐他汀对CME后TNF-α、IL-6、ICAM-1在心肌组织表达的影响 见图1～3，表2。术后7 d CME组TNF-α除了在微梗灶内残留的和周边区缺血的心肌细胞、部分“正常”心肌细胞阳性表达，血管周TNF-α阳性炎性细胞渗出明显增多（图1 A、B）。阿托伐他汀治疗后在梗死灶边心肌及其他正常心肌表达减弱，炎性细胞渗出减少（图1 C、D）。

表2 阿托伐他汀干预后心肌中TNFα、IL-6及ICAM-1 的变化（±s）

表2 阿托伐他汀干预后心肌中TNFα、IL-6及ICAM-1 的变化（±s）

注：与CME组比较，aP＜0.05

组别 例数 TNF-α IL-6 ICAM-1 CME 组 24 31.15±7.72 40.33±6.12 3.15±0.34 Atrovastatin 组 24 17.00±2.37a 21.83±2.48a 1.99±0.17a

CME后IL-6在小血管出现强表达，在血管壁上出现IL-6阳性的炎性细胞大量渗出、游走现象；同时在微梗灶内残留的和周边区缺血的心肌细胞、部分血管周围心肌细胞也有表达（图2 A、B）。阿托伐他汀治疗后在梗死灶边心肌及其他正常心肌、血管内皮表达减弱（图2 C、D）。

CME组ICAM-1在血管内皮及微梗死灶心肌表达增强（图3 A）。阿托伐他汀可抑制血管内皮及心肌中ICAM-1表达（图3 B）。

2.3 Western blot结果 Western blot结果进一步证实，阿托伐他汀可抑制CME后TNF-α、IL-6、ICAM-1在心肌中表达（图4）。

图4 Western blot检测Atrovastatin对心肌中TNF-α、IL-6及ICAM-1表达的影响

3 讨论

CME伴发炎症反应已在多项研究中得到证实，且炎症反应是引起CME心肌收缩功能低下的最重要机制。反复、多次发生CME可导致微梗死、心律失常、冠脉储备功能下降、左室重构甚至心力衰竭[1]。我们的前期研究发现，急性-亚急性期除了微梗灶周围存活的心肌，在血管内皮、部分“正常”心肌及部分小血管周边心肌均出现炎症因子如TNF-α、IL-6和ICAM-1的表达，炎症细胞大量渗出。因此，CME炎症并不是仅局限于微梗灶及周围，同时导致微循环炎症激活，波及到许多“无辜心肌”，产生“旁观者效应”。CME慢性期心室重构无法单纯用微小的梗死面积来解释，与梗塞区相比更为突出的非梗塞区炎症可能具有尤其重要的意义[7]。如何减轻CME伴发炎症反应及改善远期心室重构是我们关心的问题。ARMYDA系列研究证实，阿托伐他汀可显著降低血管成形术后心肌梗死，推测其可能通过抗炎机制发挥降低微栓塞、保护血管内皮等有益作用[8,9]。国内不少研究也显示阿托伐他汀可降低hs-CRP，间接证实存在抗炎作用保护心血管[10]。我们在研究中观察了阿托伐他汀对CME后心肌炎症反应的影响。结果显示，阿托伐他汀能显著抑制微梗灶内残留的和周边区缺血的心肌细胞、部分“正常”心肌细胞，以及血管内皮 TNF-α、IL-6、ICAM-1等炎症因子的过度产生，减少心肌中炎性细胞聚集，发挥抗炎作用，进一步减少心肌损害及远期心室重构。

阿托伐他汀对冠状动脉微栓塞后心肌炎症的影响

图1 Atrovastatin对CME后TNF-α、IL-6、ICAM-1在心肌组织表达的影响（×200）

图2 免疫组化染色Atrovastatin对CME后IL-6在心肌组织表达的影响（×200）

图3 免疫组化染色Atrovastatin对CME后ICAM-1在心肌组织表达的影响（×200）

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Roles of atrovastatin in the myocardial inflammation following coronary microembolization

LI Shu-mei＊，HUANG Zhang-min，CHEN Liang-long.＊Department of Cardiology，the 476th Clinical Department of Fuzhou General Hospital，Fuzhou 350002，China

LI Shu-mei，E-mail：zdoctor@sohu.com

ObjectiveTo investigate the roles of atrovastatin in the myocardial inflammation following coronary microembolization.MethodsCME model in 48 rats was created by injection homologous microthrombotic particle suspension into left ventricle when clamping the ascending aorta.The CME rats were randomized to untreated group and atrovastatin treated group （n=24 respectively）.The rats were sacrificed on day 7 post-operationally.The morphological characteristics were evaluated in sections with HE staining and the protein expressions of TNF-α，IL-6 and ICAM-1 were semi-quantitatively analyzed by immunohistochemistry and Western blot.ResultsAtrovastatin slightly reduced infarct size and significantly suppressed inflammatory cell infiltration and the protein expression of TNF-α，IL-6 and ICAM-1（P＜0.05）.ConclusionAtrovastatin markedly suppressed the TNF-α，IL-6 protein expression and effectively ameliorated myocardial inflammation.

Coronary microembolization； TNF-α； IL-6； ICAM-1； Statins

南京军区医学科技创新基金（项目编号：09MA104）

350002 福建省福州市，南京军区福州总院476医院心内科（李淑梅、黄章敏）；福建医科大学附属协和医院心血管内科（陈良龙）

李淑梅，E-mail：zdoctor@sohu.com

10．3969/j．issn．1672－5301．2014．01．018

Q95-33；R543.3

A

1672-5301(2014)01-0056－03

2013-04-09）