龚 沂

(南昌大学第一附属医院，江西 南昌 330006)

骨质疏松是目前老年常见的骨代谢性疾病，随着社会老龄化其发病越来越多且以绝经后妇女为主。大量的基础研究已肯定了雌激素的保护作用，但其作用机制仍不明〔1〕。近年来随着护骨素(OPG)的发现，对OPG/细胞核因子-κB受体活化因子(RANK)/细胞核因子-КB受体活化因子配体(RANKL)系统的研究受到关注，这些细胞因子在调节破骨细胞的形成和活化方面起着关键的作用，是诸多骨代谢调节激素或因子在细胞水平发挥作用的共同通道〔2，3〕。本实验通过观察17β雌二醇(17β-E2)对成骨细胞(OB)分泌的OPG、RANKL表达的影响，旨在探讨雌激素治疗骨质疏松的机制。

1 材料和方法

1.1材料 MEM培养基干粉购自GIBCO BRL公司；小牛血清、胎牛血清购自NBS GIBCO BRL公司；17β-E2、Ⅱ型胶原酶、核酸分子量标准购自Sigma公司；大鼠白血病病毒(MMLV)第一链cDNA合成试剂盒、即用PCR扩增试剂盒购自上海生物工程技术公司；OPG、RANKL引物由北京三博远志生物技术有限责任公司合成。

1.2方法

1.2.1细胞培养 酶消化法分离培养24 h内新生SD大鼠(来自南昌大学医学院动物实验科学部)颅盖骨OB，通过碱性磷酸酶染色、矿化结节染色对成骨细胞进行鉴定。

1.2.2干预试验 传代时将细胞接种于25 cm2培养瓶，汇合后加入即配的药物干预，分为对照组、10-10mol/L组、10-9mol/L组、10-8mol/L组、10-7mol/L 17β-E2组。细胞生长汇合后，抽提总RNA。

1.2.3RT-PCR检测 Trizol抽提总RNA，MMLV第一链cDNA合成试剂盒合成cDNA，PCR扩增OPG、RANKL基因，GAPDH为内对照。OPG正义：5′-TGC TTT CGA TGA CGT CTC AC-3′，反义5′-CAC TGC ACA GTC AGG AGG AA-3′，扩增长度为318 bp；RANKL正义：5′-GCG CTC GAA AGT ACA GGA AC-3′，反义：5′-AGC CGA GAC TAC GGC AAG TA-3′，扩增长度为208 bp。OPG反应条件: 94℃预变性5 min，94℃变性30 s，52℃退火60 s，72℃延伸60 s，共35个循环，最后延伸5 min。RANKL反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，56℃退火60 s，72℃延伸60 s，共35个循环，最后延伸5 min。……