何培生 唐 颖 周小平 芮晓云 周红梅

(重庆三峡中心医院普外二科，重庆 404000)

大量的研究证明miRNA参与肿瘤的发生发展、侵袭、治疗和预后等过程，具有重要的生物学功能〔1～3〕。也有文献〔4～6〕报道很多miRNA与结肠癌有关，如miR143和miR145等，但miR196a、miR146a、miR27a和miR200a等在结肠癌中的作用却未见报道。本研究检测miR196a、miR146a、miR27a和miR200a在结肠癌中的表达情况，并探讨其中差异miRNA对结肠癌细胞增殖能力和侵袭能力的影响。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞株 人结肠癌细胞株LoVo购自上海赛默生物科技发展有限公司。

1.1.2主要试剂 细胞培养用RPMI1640培养液、胎牛血清(FCS)、青霉素-链霉素(P-S双抗)等均购自美国GIBCO公司，使用前按照89∶10∶1比例配制成完全1640培养液； mRNA抽提试剂盒miRNeasy Mini Kit购自QIAGEN公司；cDNA逆转录试剂盒ReverAidTM First Strand Cdna Synthesis Kit购自Thermo公司；RT-PCR试剂盒FastvStart Universal SYBR Green Master Kit购自罗氏公司；转染试剂脂质体lipofectamine2000(简称lipo2000)购自美国Invitrogen公司；Opti-MEM I低血清培养基购自GIBCO公司；细胞计数试剂盒-8(CCK-8)购自碧云天生物技术研究所；miR27a mimics和miR27a inhibitors及阴性控制购自广州锐博公司(RiBoBio)；Matrigel购自BD Bioscience公司；Transwell侵袭小室(8 pm孔径)购自Millipore公司；细胞培养板购自美国Costar公司。

1.2方法

1.2.1病例样本和体外实验样本量 正常组为33例健康志愿者的结肠组织，大肠炎组为26例结肠炎患者的炎性结肠组织，结肠癌组为42例结肠癌患者的结肠癌组织；体外实验每组样本量n≥6，每个实验重复3次。

1.2.2RT-PCR 提RNA，逆转录为cDNA，取各组cDNA，用ddH2O稀释50倍。设定以下循环：①50℃，2 min；②95℃，10 min；③95℃，15 s；④60℃，1 min；⑤重复第③④步；⑥95℃，15 s；⑦60℃，30 s；⑧95℃，15 s。上样检测。

1.2.3细胞培养 用含10％ FCS的L-15培养基培养。所有细胞均在37℃、无CO2、饱和湿度条件下传代培养，选用对数生长期细胞进行实验。

1.2.4细胞转染实验分组 (1)对照组，无任何转染；(2)脂质体组，仅加入脂质体；……