周红丽 马 艳 崔向飞

(辽宁医学院附属第一医院肾内科，辽宁 锦州 121000)

目前关于肾脏衰老的机制尚不十分明确。肾脏衰老主要是由于肾脏固有细胞功能减退所致。肾小球系膜细胞是肾脏的主要固有细胞，其表型和功能改变在肾脏衰老进程中发挥着重要的作用。研究证实血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)可促进细胞衰老，这些研究多见于脐静脉血管内皮细胞、血管平滑肌细胞等〔1，2〕，对人肾小球系膜细胞(GMC)衰老的研究报道甚少。本文探讨AngⅡ在GMC衰老过程中的作用。

1 材料与方法

1.1实验材料 人GMC购于美国sciencell公司。4201人系膜细胞培养基(美国sciencell公司)，细胞衰老β-半乳糖苷酶(SAβ-gal)染色试剂盒(上海杰美基因有限公司)，四甲基偶氮唑蓝、AngⅡ(美国sigma公司)，胎牛血清、RPMI-1640(美国Gibco公司)，PI(上海晶美生物公司)。

1.2GMC传代培养 GMC贴壁生长于含2％胎牛血清的专用HGMC培养液中，在5％CO2、37℃和完全饱和湿度的培养箱中培养，2～3 d换液1次。用0.25％胰蛋白酶进行消化、传代。取5～8代细胞用于实验。

1.3AngⅡ诱导人GMC衰老浓度的确定 ①衰老组：用10-8、10-7、10-6、10-5、10-4mol/L AngⅡ刺激人GMC，刺激时间24、48、72、96 h；②对照组：细胞在不含任何刺激因素的培养液中培养。

1.4MTT法检测细胞增殖情况 取密度为103个/孔的GMC接种于96孔板中，待细胞贴壁后，换无血清培养基使细胞同步化12 h。对照组(6孔)每孔加入100 μl培养液，实验组(6孔)每孔加入含不同浓度AngⅡ培养液100 μl，培养至相应时间。终止培养前每孔加入MTT 10 μl培养4 h，最后加入150 μl DMSO,振荡10 min后,酶标比色仪490 nm检测波长，结果以吸光度值(OD)表示。以OD值的百分比代表存活细胞的百分数。

1.5流式细胞仪检测细胞周期 用0.25％的胰蛋白酶消化制成单细胞悬液。……