梅燚+崔彦玲+郭军+陈海丽+孟淑春

摘要:利用形态学分类法和AFLP分子标记技术对45份菠菜(Spinacia oleracea L.)育种材料的遗传多样性和亲缘关系进行了研究｡结果表明,从256对引物中筛选出18对扩增效果较好的引物,共扩增到960个条带,146个多态性位点,PIC值(平均多态信息量)为15.2%｡AFLP标记技术的聚类分析表明,第一类群主要以欧美资源和有欧美血统的杂交种为主;第二类群主要以日本资源和含有日本血统的杂交种为主;第三类群以中国本土品种为主｡从聚类结果看,与形态学的分类结果基本一致,而且聚类结果与地域来源和形态特征有一定的对应关系｡

关键词:菠菜(Spinacia oleracea L.); AFLP; 遗传多样性;亲缘关系;形态学

中图分类号:S636.1;Q7文献标识码:A文章编号:0439-8114(2014)11-2561-06

The Genetic Diversity of Breeding Materials of Spinach

MEI Yi1,2,CUI Yan-ling1,GUO Jun2,CHEN Hai-li1,MENG Shu-chun1

(1.Beijing Vegetable Research Center, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences/Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Horticultural Crops (North China)/Key Laboratory of Urban Agriculture (North), Ministry of Agriculture, Beijing 100097,China;2. Institute of Agricultural Science in Jiangsu Coastal Areas, Yancheng 224002, Jiangsu, China)

Abstract: The genetic diversity and phylogenetic relationship of 45(Spinacia oleracea L.) breeding materials of spinach were studied by traditional taxonomy and AFLP markers. The results showed that eighteen polymorphic primes pairs were screened from 256 primer pairs and 146 polymorphic bands were observed from total 960 amplified bands. The value of PIC was 15.2%. The genetic diversity of 45 spinach breeding materials with AFLP molecular markers was clustered into three groups. The first group was mainly the Europe and America varieties. The second group was mostly the Japan varieties. The third group was the Chinese varieties. The results were consisted with the traditional classification. The clusters were associated with the origins and the morphological characters of the breeding materials tested.

Key words: spinach(Spinacia oleracea L.);AFLP;genetic diversity;phylogenetic relationship; traditional taxonomy

基金项目:国家科技支撑计划课题项目(2012BAD02B04;2012BAK26B03);北京市农林科学院科技创新能力建设专项(KJCX201202001;KJCX201101010);北京市农林科学院青年科研基金项目(QNJJ201211);北京市科委重大课题项目(D131100000413001)

菠菜(Spinacia oleracea L.)是藜科(Chenopodiaceae)菠菜属(Spinacia)中的一个栽培种｡原产于伊朗,以叶片和嫩茎为食用器官,适应性广､耐储藏､供应期长､栽培方式多样,在世界各地普遍种植,是我国主要的出口蔬菜之一｡但是目前我国市场上菠菜品种混杂,研究仍相对薄弱,优良品种材料较难获得已经成为菠菜育种的严重障碍｡

关于菠菜遗传多样性及亲缘关系的研究,近年来有一些报道,采用的方法有核型分析[1]､同工酶技术[2]､RAPD技术[3]｡而使用AFLP(Amplified fragment length polymorphism)分子标记方法对菠菜进行遗传多样性和亲缘关系的研究尚未见报道｡AFLP技术于1993年由荷兰科学家Zabeau和Vos创建[4],是结合了RFLP和PCR的一种技术,兼具RFLP的稳定性和PCR的高效性,目前已被广泛应用在物种的遗传多样性分析[5]､种质资源鉴定[6]等方面｡本试验结合形态学性状分析和AFLP技术对45份菠菜材料进行了遗传多样性分析,为菠菜的种质资源收集､保存及利用提供一定的理论依据｡

1材料与方法

1.1试验材料

45份菠菜材料均由北京市农林科学院蔬菜研究中心菠菜育种课题组提供,2010年4月采集于北京市农林科学院蔬菜研究中心四季青实验农场｡试验材料名称及其来源见表1｡

1.2试验方法

1.2.1菠菜种质资源形态学调查在春､秋两季于田间采集45份菠菜样品,每个样品3次重复,调查菠菜田间质量性状,包括:株型､叶片挺直度､叶型､叶尖､叶基､叶面褶皱､叶面光泽､叶色､叶裂刻､叶柄色､抽薹期及叶厚｡对试验数据进行统计换算,利用SPSS 11.0 软件计算不同种群间的遗传相似度,绘制出聚类分析树状图｡

1.2.2AFLP分析参照CTAB法[7]并进行改良提取菠菜的基因组DNA｡基因组DNA的酶切､连接､预扩增和选择性扩增参考文献[8]进行了体系优化｡

利用稀有切点限制性内切酶(6个识别位点的PstⅠ)与多切点限制性内切酶(4个识别位点的MseⅠ)相搭配进行双酶切｡由于菠菜遗传背景相对较宽,所以采用了P+3/M+3选择性引物组合,引物名称及序列见表2｡

PCR产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳后利用强碱法[将凝胶放入第一个水槽中2~3 min漂洗7~8次,然后转到0.1%硝酸银溶液中静置染色10 min;在第二个槽中漂洗7~8次,置于1.5%氢氧化钠溶液中(含1%甲醛),显影3~5 min;再放入第一个水槽中2~3 min后漂洗7~8次]进行染色,读胶并记录｡对多态性条带进行整理并经NTSYS 2.10e､Structure 2.3软件分析,建立聚类分析树状图｡

2结果与分析

2.1菠菜种质资源田间性状聚类分析

对45份菠菜种质的形态学标记进行聚类分析,利用SPSS 11.0软件计算出不同种群间的遗传相似度,对数据进行聚类分析,构建聚类分析树状图(图1)｡如图1所示,形态学标记聚类将供试的45份菠菜种质分为3个类群｡

第一类群:美2号､美2号×全能､美3号､“06-118”､丹麦1号､美2号ד98-58”､法国5号､美2号×联､p07-22､“07-75”､强力398､荷兰5号､“98-58”×laron､冠军强力､全能×哈､美2号×罗､金成尖､法国6号×全能､福将｡该类群的品种生物学特征为半直立株型,卵形叶型,叶面微皱,叶片有光泽且颜色为深绿色,叶面较厚,抽薹较晚｡

第二类群:ﾏｾﾞぅｰ､ｱﾆﾅ､07-p50､07-p24早熟､“07-74”､全能､“9508”×尖､沈尖叶､07-p24､07-p69､金成×哈､美2号ד9858”､07-p49､ｱｽぅｽ×前卫433､07-65､07-75､ｱｽﾛｿ､“9507”×全能､全能ד9780”､p5｡此类群的主要特征是株型为半直立,叶型为椭圆形,叶面微皱,叶色为绿色,抽薹期适中｡

第三类群:西安大叶､虎耳菜､p40-1､“07-86”､大叶､哈×全能｡此类群的主要特征是株型为半直立,叶面微皱,叶色为绿色,叶裂刻浅,叶片厚度较薄｡

利用形态学标记方法对45份菠菜育种材料进行分类,从地理分布来看,基本上可以把不同地理分布的菠菜材料分开,以欧美品种和含有欧美血统的杂交种的材料聚为同一类群,以日本品种和含有日本血统的杂交种聚为同一类群,以中国品种和含有中国血统的杂交种聚为一个类群｡

2.2菠菜种质田间形状的相关性分析

利用SPSS 11.0软件对45份菠菜育种材料的12个田间性状进行相关性分析｡结果表明,有4组田间性状呈极显著负相关,株型和叶型(相似系数-0.351)､株型和叶面褶皱(-0.518)､叶面挺直度和叶尖(-0.384)､叶尖和株型(-0.494)｡其中负相关性最大的是株型和叶面褶皱(-0.518),即株型越开展,叶面的褶皱越多;有6组田间性状呈极显著正相关,叶型和叶尖(0.636)､叶型和叶面光泽(0.469)､叶面褶皱和叶尖(0.542)､叶尖和叶厚(0.413)､叶面褶皱和叶厚(0.493)､叶色和抽薹期(0.413)｡其中正相关性最大的是叶型和叶尖(0.636),说明叶尖很大程度上决定了叶片形状,研究比较了各种质量性状之间的关联性,为下一步研究其控制机理提供依据｡

利用SPSS 11.0软件分析了菠菜种质田间性状之间的关联程度,并绘制成聚类图｡由图2可知,菠菜的许多田间性状关联性很强,鉴于这些性状,分别针对每对相关性很高的性状设计完整的试验,进一步证实其相关的可靠性,从分子水平上进行QTL定位,验证其性状的位点与田间相关性试验结果的一致性｡

2.3AFLP分析

本试验用256对引物组合筛选出18对扩增效果较好的引物,分别是4769､4770､4776､5176､5264､5266､5268､5269､5270､5271､5276､5476､5563､5568､5569､5572､5578､5669(图3)｡用18对引物对45份菠菜种质进行分析,共扩增出960个条带,146个多态性位点,PIC值为15.2%｡

2.4菠菜种质AFLP分子标记聚类分析

利用NTSYS 2.10e软件对AFLP分子标记统计数据进行聚类分析,取遗传相似系数为0.68时,可将45份菠菜种质分为三大类群(图4)｡

第一类群:美3号､荷兰5号､美2号､“07-75”､金成×哈､丹麦1号､全能×哈､美2号×全能､沈尖叶､美2号×罗､美2号×联､福将､美2号ד98-58”､p07-22､“9507”×全能､美2号ד9858”､金成尖､“9508”×尖､ｱﾆﾅ､全能､法国5号｡其中欧美材料有7个,日本材料有4份,中国材料有1份,杂交种有9份(其中有5个含有欧美血统)｡此类群主要以欧美材料和含有欧美血统的杂交种为主｡主要特征为株型半直立,叶色深绿,抽薹期较晚,叶片有光泽且较厚｡

第二类群:法国6号×全能､07-p24､全能ד9780”､ｱｽぅｽ×前卫433､ﾏｾﾞぅｰ､冠军强力､“07-65”､07-p24早熟､“07-74”､07-p50､“98-58”×laron､07-p49､07-p69､ｱｽﾛｿ､强力398､大叶,此类主要以日本材料和含有日本血统的杂交种为主,其中日本材料12份,杂交种4份(都含有日本血统),没有欧美材料和中国材料｡主要特征为叶片绿色,抽薹期适中,叶面微皱,叶片为椭圆形｡

第三类群:p5､p40-1､虎耳菜､西安大叶､哈×全能､“07-86”､“06-118”､“07-75”｡中国材料6份,日本材料1份,1个杂交种(含有中国血统),没有欧美材料｡此类群以中国材料为主,主要特征是叶色较浅,株型的直立性较强,抽薹比较早,叶片褶皱较少,叶片较薄｡

从AFLP标记分析的结果可以看出,大多数来自同一地区或有此地区血统的资源聚到了一类,但还有一些例外,尤其是来自日本的品种｡主要是由于育种材料中选取的日本材料比较多,所以相对于中国和欧美材料来说,多样性丰富一点,而且日本菠菜育种一直居于世界领先地位,试验所用的一些材料很可能是日本材料和其他地区材料经过改良后得到的产物,所以这些材料的自交系会分到其他类群｡而一些遗传背景很相似的材料却被分在不同的类群,可能因为它们是多代自交系,第一代的种子较杂,后代分离比较大,而且也有可能和杂交技术有关｡

利用Structure 2.3软件对45份菠菜种质进行Q值计算,结果表明(表3),除5份材料以外,其余材料的主成分都大于0.7,最大的达到0.981,说明所选育种材料的归属比较明确,同一类群内亲缘关系比较近,同时样品中还存在其他类的成分,但其含量较少,说明类与类之间的亲缘关系比较远｡

3讨论

利用AFLP分子标记的方法,对256对P+3/M+3引物组合进行筛选,选出18对多态性较高,且条带清晰的引物组合｡这18对引物组合共获得960条清晰可辨的条带,其中有146个多态性位点,平均多态信息量为15.2%,最终把45份菠菜种质材料分为三类｡分别是欧美类群､日本类群､中国类群,根据Structure 2.3软件计算Q值,可以得出中国类群和日本类群亲缘关系较近,与欧美类群亲缘关系较远｡

同时通过统计12个田间性状,利用形态学分类的方法也把种质材料分为三类,并且两种分类方法的结果有70%左右是吻合的,45份材料中分类不一致的有14个样品｡说明传统的形态学性状分类和现代分子标记分类在结论上比较一致,但是由于两种分类方法基于的原理不同,其分析结果就不会完全一致｡田间性状是根据植株外形上和品质上的差异对其分类,优点是简单､有效､实用､费用较低｡缺点是容易受外界环境条件和人为主观判断等因素的影响,此方法适用于粗略的分类｡AFLP分子标记是从DNA水平上直接根据基因的差异来分类,其优点是准确､不受外界环境和人为主观判断的影响,缺点是费用较高､耗时较长､难度较大,但可以对亲缘关系较近的材料进行较为准确的遗传分析｡所以两种方法各有所长,要根据材料的具体情况决定使用的方法｡

本研究在DNA分子水平上证明了我国菠菜种质具有较广泛的遗传背景,从而为菠菜属种质资源开发利用以及新品种的选育提供了参考｡

参考文献:

[1] LAN T, ZHANG S, LIU B, et a1.Differentiating sex chromosomes of the dioecious Spinacia oleracea L.(spinach)by FISH of 45S rDNA[J].Cytogenet Genome Res,2006,114(2):175-177.

[2] 高武军,肖理会,卢龙斗,等.菠菜的性别相关同工酶标记分析[J].河南师范大学学报(自然科学版),2006,34(4):147-150.

[3] 杨金华,邓传良,张准超,等.菠菜性别相关RAPD分子标记体系的建立与优化[J].江苏农业科学,2009(2):40-42.

[4] 王和勇,陈敏,廖志华,等. RFLP､RAPD､AFLP分子标记及其在植物生物技术中的应用[J].生物学杂志,1999,16(4):24-25.

[5] 徐志红, 徐永阳, 刘君璞,等.甜瓜种质资源遗传多样性及亲缘关系研究[J].果树学报, 2008, 25(4):552-558.

[6] 滕彩珠,刁 英,易继碧,等.魔芋种质资源的AFLP分析[J].氨基酸和生物资源, 2006, 28(4):33-35.

[7] PATERSON A H, LANDER E S, HEWITT J D, et al. Resolution of quantitative traits into Mendelian factors by using a complete linkage map of restriction fragment length polymorphism[J]. Nature, 1998, 335:721-726.

[8] 梅燚,侯雷平,孟淑春,等.菠菜AFLP反应体系初探[J].华北农学报,2010,25(4):111-115.

2结果与分析

2.1菠菜种质资源田间性状聚类分析

对45份菠菜种质的形态学标记进行聚类分析,利用SPSS 11.0软件计算出不同种群间的遗传相似度,对数据进行聚类分析,构建聚类分析树状图(图1)｡如图1所示,形态学标记聚类将供试的45份菠菜种质分为3个类群｡

第一类群:美2号､美2号×全能､美3号､“06-118”､丹麦1号､美2号ד98-58”､法国5号､美2号×联､p07-22､“07-75”､强力398､荷兰5号､“98-58”×laron､冠军强力､全能×哈､美2号×罗､金成尖､法国6号×全能､福将｡该类群的品种生物学特征为半直立株型,卵形叶型,叶面微皱,叶片有光泽且颜色为深绿色,叶面较厚,抽薹较晚｡

第二类群:ﾏｾﾞぅｰ､ｱﾆﾅ､07-p50､07-p24早熟､“07-74”､全能､“9508”×尖､沈尖叶､07-p24､07-p69､金成×哈､美2号ד9858”､07-p49､ｱｽぅｽ×前卫433､07-65､07-75､ｱｽﾛｿ､“9507”×全能､全能ד9780”､p5｡此类群的主要特征是株型为半直立,叶型为椭圆形,叶面微皱,叶色为绿色,抽薹期适中｡

第三类群:西安大叶､虎耳菜､p40-1､“07-86”､大叶､哈×全能｡此类群的主要特征是株型为半直立,叶面微皱,叶色为绿色,叶裂刻浅,叶片厚度较薄｡

利用形态学标记方法对45份菠菜育种材料进行分类,从地理分布来看,基本上可以把不同地理分布的菠菜材料分开,以欧美品种和含有欧美血统的杂交种的材料聚为同一类群,以日本品种和含有日本血统的杂交种聚为同一类群,以中国品种和含有中国血统的杂交种聚为一个类群｡

2.2菠菜种质田间形状的相关性分析

利用SPSS 11.0软件对45份菠菜育种材料的12个田间性状进行相关性分析｡结果表明,有4组田间性状呈极显著负相关,株型和叶型(相似系数-0.351)､株型和叶面褶皱(-0.518)､叶面挺直度和叶尖(-0.384)､叶尖和株型(-0.494)｡其中负相关性最大的是株型和叶面褶皱(-0.518),即株型越开展,叶面的褶皱越多;有6组田间性状呈极显著正相关,叶型和叶尖(0.636)､叶型和叶面光泽(0.469)､叶面褶皱和叶尖(0.542)､叶尖和叶厚(0.413)､叶面褶皱和叶厚(0.493)､叶色和抽薹期(0.413)｡其中正相关性最大的是叶型和叶尖(0.636),说明叶尖很大程度上决定了叶片形状,研究比较了各种质量性状之间的关联性,为下一步研究其控制机理提供依据｡

利用SPSS 11.0软件分析了菠菜种质田间性状之间的关联程度,并绘制成聚类图｡由图2可知,菠菜的许多田间性状关联性很强,鉴于这些性状,分别针对每对相关性很高的性状设计完整的试验,进一步证实其相关的可靠性,从分子水平上进行QTL定位,验证其性状的位点与田间相关性试验结果的一致性｡

2.3AFLP分析

本试验用256对引物组合筛选出18对扩增效果较好的引物,分别是4769､4770､4776､5176､5264､5266､5268､5269､5270､5271､5276､5476､5563､5568､5569､5572､5578､5669(图3)｡用18对引物对45份菠菜种质进行分析,共扩增出960个条带,146个多态性位点,PIC值为15.2%｡

2.4菠菜种质AFLP分子标记聚类分析

利用NTSYS 2.10e软件对AFLP分子标记统计数据进行聚类分析,取遗传相似系数为0.68时,可将45份菠菜种质分为三大类群(图4)｡

第一类群:美3号､荷兰5号､美2号､“07-75”､金成×哈､丹麦1号､全能×哈､美2号×全能､沈尖叶､美2号×罗､美2号×联､福将､美2号ד98-58”､p07-22､“9507”×全能､美2号ד9858”､金成尖､“9508”×尖､ｱﾆﾅ､全能､法国5号｡其中欧美材料有7个,日本材料有4份,中国材料有1份,杂交种有9份(其中有5个含有欧美血统)｡此类群主要以欧美材料和含有欧美血统的杂交种为主｡主要特征为株型半直立,叶色深绿,抽薹期较晚,叶片有光泽且较厚｡

第二类群:法国6号×全能､07-p24､全能ד9780”､ｱｽぅｽ×前卫433､ﾏｾﾞぅｰ､冠军强力､“07-65”､07-p24早熟､“07-74”､07-p50､“98-58”×laron､07-p49､07-p69､ｱｽﾛｿ､强力398､大叶,此类主要以日本材料和含有日本血统的杂交种为主,其中日本材料12份,杂交种4份(都含有日本血统),没有欧美材料和中国材料｡主要特征为叶片绿色,抽薹期适中,叶面微皱,叶片为椭圆形｡

第三类群:p5､p40-1､虎耳菜､西安大叶､哈×全能､“07-86”､“06-118”､“07-75”｡中国材料6份,日本材料1份,1个杂交种(含有中国血统),没有欧美材料｡此类群以中国材料为主,主要特征是叶色较浅,株型的直立性较强,抽薹比较早,叶片褶皱较少,叶片较薄｡

从AFLP标记分析的结果可以看出,大多数来自同一地区或有此地区血统的资源聚到了一类,但还有一些例外,尤其是来自日本的品种｡主要是由于育种材料中选取的日本材料比较多,所以相对于中国和欧美材料来说,多样性丰富一点,而且日本菠菜育种一直居于世界领先地位,试验所用的一些材料很可能是日本材料和其他地区材料经过改良后得到的产物,所以这些材料的自交系会分到其他类群｡而一些遗传背景很相似的材料却被分在不同的类群,可能因为它们是多代自交系,第一代的种子较杂,后代分离比较大,而且也有可能和杂交技术有关｡

利用Structure 2.3软件对45份菠菜种质进行Q值计算,结果表明(表3),除5份材料以外,其余材料的主成分都大于0.7,最大的达到0.981,说明所选育种材料的归属比较明确,同一类群内亲缘关系比较近,同时样品中还存在其他类的成分,但其含量较少,说明类与类之间的亲缘关系比较远｡

3讨论

利用AFLP分子标记的方法,对256对P+3/M+3引物组合进行筛选,选出18对多态性较高,且条带清晰的引物组合｡这18对引物组合共获得960条清晰可辨的条带,其中有146个多态性位点,平均多态信息量为15.2%,最终把45份菠菜种质材料分为三类｡分别是欧美类群､日本类群､中国类群,根据Structure 2.3软件计算Q值,可以得出中国类群和日本类群亲缘关系较近,与欧美类群亲缘关系较远｡

同时通过统计12个田间性状,利用形态学分类的方法也把种质材料分为三类,并且两种分类方法的结果有70%左右是吻合的,45份材料中分类不一致的有14个样品｡说明传统的形态学性状分类和现代分子标记分类在结论上比较一致,但是由于两种分类方法基于的原理不同,其分析结果就不会完全一致｡田间性状是根据植株外形上和品质上的差异对其分类,优点是简单､有效､实用､费用较低｡缺点是容易受外界环境条件和人为主观判断等因素的影响,此方法适用于粗略的分类｡AFLP分子标记是从DNA水平上直接根据基因的差异来分类,其优点是准确､不受外界环境和人为主观判断的影响,缺点是费用较高､耗时较长､难度较大,但可以对亲缘关系较近的材料进行较为准确的遗传分析｡所以两种方法各有所长,要根据材料的具体情况决定使用的方法｡

本研究在DNA分子水平上证明了我国菠菜种质具有较广泛的遗传背景,从而为菠菜属种质资源开发利用以及新品种的选育提供了参考｡

参考文献:

[1] LAN T, ZHANG S, LIU B, et a1.Differentiating sex chromosomes of the dioecious Spinacia oleracea L.(spinach)by FISH of 45S rDNA[J].Cytogenet Genome Res,2006,114(2):175-177.

[2] 高武军,肖理会,卢龙斗,等.菠菜的性别相关同工酶标记分析[J].河南师范大学学报(自然科学版),2006,34(4):147-150.

[3] 杨金华,邓传良,张准超,等.菠菜性别相关RAPD分子标记体系的建立与优化[J].江苏农业科学,2009(2):40-42.

[4] 王和勇,陈敏,廖志华,等. RFLP､RAPD､AFLP分子标记及其在植物生物技术中的应用[J].生物学杂志,1999,16(4):24-25.

[5] 徐志红, 徐永阳, 刘君璞,等.甜瓜种质资源遗传多样性及亲缘关系研究[J].果树学报, 2008, 25(4):552-558.

[6] 滕彩珠,刁 英,易继碧,等.魔芋种质资源的AFLP分析[J].氨基酸和生物资源, 2006, 28(4):33-35.

[7] PATERSON A H, LANDER E S, HEWITT J D, et al. Resolution of quantitative traits into Mendelian factors by using a complete linkage map of restriction fragment length polymorphism[J]. Nature, 1998, 335:721-726.

[8] 梅燚,侯雷平,孟淑春,等.菠菜AFLP反应体系初探[J].华北农学报,2010,25(4):111-115.

2结果与分析

2.1菠菜种质资源田间性状聚类分析

对45份菠菜种质的形态学标记进行聚类分析,利用SPSS 11.0软件计算出不同种群间的遗传相似度,对数据进行聚类分析,构建聚类分析树状图(图1)｡如图1所示,形态学标记聚类将供试的45份菠菜种质分为3个类群｡

第一类群:美2号､美2号×全能､美3号､“06-118”､丹麦1号､美2号ד98-58”､法国5号､美2号×联､p07-22､“07-75”､强力398､荷兰5号､“98-58”×laron､冠军强力､全能×哈､美2号×罗､金成尖､法国6号×全能､福将｡该类群的品种生物学特征为半直立株型,卵形叶型,叶面微皱,叶片有光泽且颜色为深绿色,叶面较厚,抽薹较晚｡

第二类群:ﾏｾﾞぅｰ､ｱﾆﾅ､07-p50､07-p24早熟､“07-74”､全能､“9508”×尖､沈尖叶､07-p24､07-p69､金成×哈､美2号ד9858”､07-p49､ｱｽぅｽ×前卫433､07-65､07-75､ｱｽﾛｿ､“9507”×全能､全能ד9780”､p5｡此类群的主要特征是株型为半直立,叶型为椭圆形,叶面微皱,叶色为绿色,抽薹期适中｡

第三类群:西安大叶､虎耳菜､p40-1､“07-86”､大叶､哈×全能｡此类群的主要特征是株型为半直立,叶面微皱,叶色为绿色,叶裂刻浅,叶片厚度较薄｡

利用形态学标记方法对45份菠菜育种材料进行分类,从地理分布来看,基本上可以把不同地理分布的菠菜材料分开,以欧美品种和含有欧美血统的杂交种的材料聚为同一类群,以日本品种和含有日本血统的杂交种聚为同一类群,以中国品种和含有中国血统的杂交种聚为一个类群｡

2.2菠菜种质田间形状的相关性分析

利用SPSS 11.0软件对45份菠菜育种材料的12个田间性状进行相关性分析｡结果表明,有4组田间性状呈极显著负相关,株型和叶型(相似系数-0.351)､株型和叶面褶皱(-0.518)､叶面挺直度和叶尖(-0.384)､叶尖和株型(-0.494)｡其中负相关性最大的是株型和叶面褶皱(-0.518),即株型越开展,叶面的褶皱越多;有6组田间性状呈极显著正相关,叶型和叶尖(0.636)､叶型和叶面光泽(0.469)､叶面褶皱和叶尖(0.542)､叶尖和叶厚(0.413)､叶面褶皱和叶厚(0.493)､叶色和抽薹期(0.413)｡其中正相关性最大的是叶型和叶尖(0.636),说明叶尖很大程度上决定了叶片形状,研究比较了各种质量性状之间的关联性,为下一步研究其控制机理提供依据｡

利用SPSS 11.0软件分析了菠菜种质田间性状之间的关联程度,并绘制成聚类图｡由图2可知,菠菜的许多田间性状关联性很强,鉴于这些性状,分别针对每对相关性很高的性状设计完整的试验,进一步证实其相关的可靠性,从分子水平上进行QTL定位,验证其性状的位点与田间相关性试验结果的一致性｡

2.3AFLP分析

本试验用256对引物组合筛选出18对扩增效果较好的引物,分别是4769､4770､4776､5176､5264､5266､5268､5269､5270､5271､5276､5476､5563､5568､5569､5572､5578､5669(图3)｡用18对引物对45份菠菜种质进行分析,共扩增出960个条带,146个多态性位点,PIC值为15.2%｡

2.4菠菜种质AFLP分子标记聚类分析

利用NTSYS 2.10e软件对AFLP分子标记统计数据进行聚类分析,取遗传相似系数为0.68时,可将45份菠菜种质分为三大类群(图4)｡

第一类群:美3号､荷兰5号､美2号､“07-75”､金成×哈､丹麦1号､全能×哈､美2号×全能､沈尖叶､美2号×罗､美2号×联､福将､美2号ד98-58”､p07-22､“9507”×全能､美2号ד9858”､金成尖､“9508”×尖､ｱﾆﾅ､全能､法国5号｡其中欧美材料有7个,日本材料有4份,中国材料有1份,杂交种有9份(其中有5个含有欧美血统)｡此类群主要以欧美材料和含有欧美血统的杂交种为主｡主要特征为株型半直立,叶色深绿,抽薹期较晚,叶片有光泽且较厚｡

第二类群:法国6号×全能､07-p24､全能ד9780”､ｱｽぅｽ×前卫433､ﾏｾﾞぅｰ､冠军强力､“07-65”､07-p24早熟､“07-74”､07-p50､“98-58”×laron､07-p49､07-p69､ｱｽﾛｿ､强力398､大叶,此类主要以日本材料和含有日本血统的杂交种为主,其中日本材料12份,杂交种4份(都含有日本血统),没有欧美材料和中国材料｡主要特征为叶片绿色,抽薹期适中,叶面微皱,叶片为椭圆形｡

第三类群:p5､p40-1､虎耳菜､西安大叶､哈×全能､“07-86”､“06-118”､“07-75”｡中国材料6份,日本材料1份,1个杂交种(含有中国血统),没有欧美材料｡此类群以中国材料为主,主要特征是叶色较浅,株型的直立性较强,抽薹比较早,叶片褶皱较少,叶片较薄｡

从AFLP标记分析的结果可以看出,大多数来自同一地区或有此地区血统的资源聚到了一类,但还有一些例外,尤其是来自日本的品种｡主要是由于育种材料中选取的日本材料比较多,所以相对于中国和欧美材料来说,多样性丰富一点,而且日本菠菜育种一直居于世界领先地位,试验所用的一些材料很可能是日本材料和其他地区材料经过改良后得到的产物,所以这些材料的自交系会分到其他类群｡而一些遗传背景很相似的材料却被分在不同的类群,可能因为它们是多代自交系,第一代的种子较杂,后代分离比较大,而且也有可能和杂交技术有关｡

利用Structure 2.3软件对45份菠菜种质进行Q值计算,结果表明(表3),除5份材料以外,其余材料的主成分都大于0.7,最大的达到0.981,说明所选育种材料的归属比较明确,同一类群内亲缘关系比较近,同时样品中还存在其他类的成分,但其含量较少,说明类与类之间的亲缘关系比较远｡

3讨论

利用AFLP分子标记的方法,对256对P+3/M+3引物组合进行筛选,选出18对多态性较高,且条带清晰的引物组合｡这18对引物组合共获得960条清晰可辨的条带,其中有146个多态性位点,平均多态信息量为15.2%,最终把45份菠菜种质材料分为三类｡分别是欧美类群､日本类群､中国类群,根据Structure 2.3软件计算Q值,可以得出中国类群和日本类群亲缘关系较近,与欧美类群亲缘关系较远｡

同时通过统计12个田间性状,利用形态学分类的方法也把种质材料分为三类,并且两种分类方法的结果有70%左右是吻合的,45份材料中分类不一致的有14个样品｡说明传统的形态学性状分类和现代分子标记分类在结论上比较一致,但是由于两种分类方法基于的原理不同,其分析结果就不会完全一致｡田间性状是根据植株外形上和品质上的差异对其分类,优点是简单､有效､实用､费用较低｡缺点是容易受外界环境条件和人为主观判断等因素的影响,此方法适用于粗略的分类｡AFLP分子标记是从DNA水平上直接根据基因的差异来分类,其优点是准确､不受外界环境和人为主观判断的影响,缺点是费用较高､耗时较长､难度较大,但可以对亲缘关系较近的材料进行较为准确的遗传分析｡所以两种方法各有所长,要根据材料的具体情况决定使用的方法｡

本研究在DNA分子水平上证明了我国菠菜种质具有较广泛的遗传背景,从而为菠菜属种质资源开发利用以及新品种的选育提供了参考｡

参考文献:

[1] LAN T, ZHANG S, LIU B, et a1.Differentiating sex chromosomes of the dioecious Spinacia oleracea L.(spinach)by FISH of 45S rDNA[J].Cytogenet Genome Res,2006,114(2):175-177.

[2] 高武军,肖理会,卢龙斗,等.菠菜的性别相关同工酶标记分析[J].河南师范大学学报(自然科学版),2006,34(4):147-150.

[3] 杨金华,邓传良,张准超,等.菠菜性别相关RAPD分子标记体系的建立与优化[J].江苏农业科学,2009(2):40-42.

[4] 王和勇,陈敏,廖志华,等. RFLP､RAPD､AFLP分子标记及其在植物生物技术中的应用[J].生物学杂志,1999,16(4):24-25.

[5] 徐志红, 徐永阳, 刘君璞,等.甜瓜种质资源遗传多样性及亲缘关系研究[J].果树学报, 2008, 25(4):552-558.

[6] 滕彩珠,刁 英,易继碧,等.魔芋种质资源的AFLP分析[J].氨基酸和生物资源, 2006, 28(4):33-35.

[7] PATERSON A H, LANDER E S, HEWITT J D, et al. Resolution of quantitative traits into Mendelian factors by using a complete linkage map of restriction fragment length polymorphism[J]. Nature, 1998, 335:721-726.

[8] 梅燚,侯雷平,孟淑春,等.菠菜AFLP反应体系初探[J].华北农学报,2010,25(4):111-115.