陈东来 张福全 桑永华 朱蓉英 张洪涛 陈勇兵

细胞的凋亡抑制在肺癌的发生发展中起重要作用[1]。X连锁凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis, XIAP）相关因子1（XAF1）是新鉴定的肿瘤抑制基因，在许多肿瘤组织和肿瘤细胞株中低表达甚至不表达[2]。新近研究[3,4]发现，XAF1在肿瘤细胞中高表达可抑制胃癌细胞、肺鳞癌细胞的生长，并诱导肿瘤细胞凋亡，增加肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性。但对肺腺癌细胞作用如何尚未见相关研究报道。本实验以重组腺病毒为载体，研究过表达XAF1基因对人肺腺癌细胞A549的增殖和诱导细胞凋亡的作用及机制，为腺病毒介导XAF1基因治疗肺腺癌提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 逆转录试剂盒购自Promega公司；甲基噻唑基四唑（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）购自Sigma公司，Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自BD公司；RIPA裂解液购自上海申能博彩公司；XAF1抗体购自Abcam公司；PARP、Caspase-3和Caspase-8抗体购自Cell Signaling Technology公司；β-actin抗体购自Sigma公司；RNA提取试剂盒和辣根过氧化物酶连接的二抗购自北京康为世纪公司；增强化学发光荧光试剂ECL购自Amersham bioscience公司；XAF1和β-actin引物由上海生工生物公司合成，以β-actin为内参照。

1.2 细胞培养 人肺腺癌A549细胞购自中国科学院上海细胞生物学研究所，为贴壁细胞，用含10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培养基（Gibco公司）培养和传代（37oC、5%CO2）。

1.3 重组腺病毒 Ad5/F35-XAF1和对照空病毒Ad5/F35-Null由北京本元正阳公司合成与扩增，转染滴度分别0.69×1010PFU/mL和1.26×1010PFU/mL。

1.4 逆转录聚合酶链式反应（reverse transcriptase polymerase chain reaction, RT-PCR） 采用试剂盒抽取细胞总RNA，测定RNA浓度，并逆转成cDNA。XAF1引物上游：5’-TCCGCAATTCATGCTCCACGAGTCCTA CTG-3’，下游：5’-ACGCGTCGACAAACTCTGAGTCTG GACAAC-3’，产物大小260 bp。内参照β-actin引物上游：5’-ATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTGC-3’，下游：5’-CGTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTGC-3’，产物大小830 bp。PCR反应条件：95oC、3 min；94oC、45 s，57oC、45 s，72oC、45 s，共30个循环。最后72oC延伸6 min。……