李孙华，靳 亮

(1.天津天士力研究院，300410，天津；2.江西省科学院微生物研究所，330029，南昌)

乙型流感病毒在不同胚龄鸡胚中适宜孵育条件的研究

李孙华1，靳 亮2*

(1.天津天士力研究院，300410，天津；2.江西省科学院微生物研究所，330029，南昌)

为了找出乙型流感病毒毒株在不同胚龄鸡胚中适宜孵育条件，提升血凝滴度，从而为产业化生产人用3价流感疫苗提高产能，主要采用血凝法检定收获尿囊液，分析试验血凝滴度数据，得出结论：乙型流感病毒毒株接种于10 d胚龄鸡胚，其孵育温度为35 ℃，孵育时间72 h最理想；孵育温度和时间对乙型流感病毒的血凝滴度有影响，同时鸡胚胚龄与其的血凝滴度和收获尿囊液量也有明显的关联。

乙型流感病毒；鸡胚；孵育；血凝滴度

0 引言

流行性感冒病毒，简称流感病毒(Influenza virus)，是一种造成人、狗、马、猪及禽类等患流行性感冒的RNA病毒[1]。在病毒分类学上，流感病毒属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，可分为甲型流感病毒(Influenza A virus)、乙型流感病毒(Influenza B virus)和丙型流感病毒(Influenza C virus)3个型。甲型流感病毒根据其表面(H和N)结构及其基因特性的不同又可分成许多亚型；目前，甲型流感病毒已发现有15个亚型(H1～15)，神经氨酸酶有9个亚型(N1～9)。而乙型和丙型流感病毒无亚型划分[2-3]。目前，市售的人用3价流感病毒疫苗含有2个甲型和1个乙型病毒株的表面蛋白，因此在制备流感疫苗生产中都采用世界卫生组织(WHO)年度推荐的、并经中国国家食品药品监督管理局批准的人用流感病毒毒株H1N1、H3N2、乙型3种的流感病毒毒株。而根据流感病毒的变异性，甲型流感病毒有着极强的变异性，乙型次之的特点，从而造成大多数的研究都集中在甲型流感病毒上，而缺少了对乙型流感病毒更基础的研究[4-5]。

目前，国际主流在流感疫苗生产中都选用鸡胚作为流感病毒生长基质，但是相对于甲型流感病毒，乙型流感病毒在鸡胚中复制力弱，血凝滴度低，收率差等缺点，直接影响到流感疫苗生产产能。本文通过对乙型流感病毒毒株接种鸡胚的日胚龄、孵育时间和温度条件的探索，获得了乙型流感病毒毒株在鸡胚中孵育的最佳条件，这将为流感疫苗产业化提供科学依据。

1 实验与方法

1.1实验材料

B/Brisbane/60/2008由英国国家生物制品检定所(NIBSC)提供；SPF鸡胚由北京梅里亚维通实验动物技术有限公司提供。

1.2试验方法

1.2.1 温度生长适应性试验 将已达11 d胚龄的SPF鸡胚，鸡胚气室朝上，暂放于温度39 ℃、相对湿度50%的中小型电脑III孵箱中。用照蛋器检查鸡胚，选出发育良好鸡胚，并画出气室边缘和胎位，在胚胎面与气室交界边缘约1 mm处并避开血管粗壮、密集处做一小点标记，以作为注射点，接种病毒滴度为6.5(lgEID50/mL)的病毒稀释液，每枚鸡胚接种剂量为0.2 mL，接种30枚鸡胚，分别放入温度为32 ℃、33 ℃、34 ℃、35 ℃、36 ℃、37 ℃下进行72 h孵育，采用血凝法检定收获尿囊液，根据血凝滴度检测结果，确定乙型流感病毒温度生长适应性。

1.2.2 不同孵育时间试验 将已达11 d胚龄的SPF鸡胚，接种病毒滴度为6.5(lgEID50/mL)的病毒稀释液，每枚鸡胚接种剂量为0.2 mL，接种30枚鸡胚，分为6组，在确定的孵育温度分别进行24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h孵育，采用血凝法检定收获尿囊液，根据血凝滴度检测结果，确定乙型流感病毒理想的孵育时间。

1.2.3 不同胚龄鸡胚中的表达试验 在确定的孵育温度和时间进行孵育，每枚鸡胚接种剂量为0.2 mL，将病毒滴度为6.5(lgEID50/mL)的病毒稀释液接种7 d、8 d、9 d、10 d、11 d、12 d胚龄6组的鸡胚中，进行孵育，采用血凝法测定收获尿囊液，根据血凝滴度检定结果及收获量，确定乙型流感病毒接种鸡胚的胚龄。

1.2.4 检定方法—血凝法 倍比稀释：根据预测测定某一样品血凝滴度所需的孔数，在血凝板上确定一系列孔位置并标明，注意这一系列孔必须在同一块血凝板上。向这一系列孔中的第1孔加入0.45 mL无菌氯化钠溶液，其它孔均加0.25 mL无菌氯化钠溶液。吸取0.05 mL供试品加入第1孔中，轻轻吸吹混匀，吸出0.25 mL置第2孔中，再吸吹混匀后吸出0.25 mL置第3孔中，以相同方式稀释至最后一孔，最后一孔弃掉0.25 mL。于每孔中加入0.25 mL鸡血红细胞悬液，包括样品孔和阴性对照孔。轻轻震动血凝板使每个孔内液体混匀后，室温下静置30-40 min即可记录。

结果记录：细血凝每孔均记录血细胞沉集结果，以++++、+++、++、+、-表示之。一层红细胞均匀地铺于孔上者为++++；基本同上，但边缘不整齐，铺的面积稍小些者为+++；红细胞形成一个环状，四周有小凝集块者为++；红细胞形成一个小团，但边缘不光滑，四周有小凝集块者为+；红细胞于孔底形成一个小团，边缘光滑并有立体感，四周无小凝集块者为-。血凝滴度计算：系列中有++孔，以稀释倍数最小的为滴定终点，滴度为该孔稀释倍数。

2 结果与分析

2.1温度生长适应性

将接种乙型流感病毒的SPF鸡胚，放入不同温度下进行72 h孵育，采用血凝法检定收获尿囊液，根据血凝滴度结果，确定乙型流感病毒最佳孵育温度。结果见表1。

从表1可知，不同温度下孵育，平均血凝滴度有明显的变化。孵育温度32 ℃的平均血凝滴度为1:88，值最小，然后随温度升高，血凝滴度值也随之升高，孵育温度35 ℃的平均血凝滴度达到最高值，结果为1:384，然后随着温度升高，血凝滴度反而降低。因此，确定乙型流感病毒最佳孵育温度为35 ℃。

表1 不同孵育温度的血凝滴度

2.2不同孵育时间

将接种乙型流感病毒的SPF鸡胚，放入35 ℃的孵化箱中，进行不同时间孵育，采用血凝法检定收获尿囊液，根据血凝滴度结果，确定乙型流感病毒最理想的孵育时间。结果见表2。

表2 不同收获时间的血凝滴度

从表2可知，24 h时收获，血凝滴度最低，平均值为1:18；孵育36 h、48 h、60 h，血凝滴度不理想，没有达到最高值；72 h的血凝滴度整体稳定，达到最高值，84 h的血凝滴度有微小的回落。因此，确定乙型流感病毒最佳孵育时间为72 h。

2.3不同胚龄鸡胚中的表达

在最优的孵育温度和时间条件下进行孵育，每枚鸡胚接种剂量为0.2 mL，将病毒稀释液接种不同胚龄6组的SPF鸡胚中，放入35 ℃的孵化箱中，进行72 h孵育，采用血凝法检定收获尿囊液，并且测定收获尿囊液体积，根据血凝滴度检测结果及收获量，确定乙型流感病毒接种最合适胚龄的鸡胚。结果见表3。

表3 不同胚龄鸡胚的血凝滴度及收获量

从表3可知，接种胚龄7 d的鸡胚时，血凝滴度最低，均值为1:100；然后随接种胚龄增加，血凝滴度也随之升高，接种胚龄10 d的均值达到最高值，结果为1:528；11 d、12 d结果趋于稳定。另外，从尿囊液收获量来看，接种胚龄7 d的鸡胚时，收获量不理想，均值为7.2 mL；然后随接种胚龄增加，收获量也随之增加，接种胚龄10 d的均值达到最高值，结果为10.4 mL；随后，收获量急剧下降，接种胚龄12 d的均值只有1.9 mL。结合血凝滴度和尿囊液收获量，认为乙型流感病毒接种10 d胚龄的鸡胚最合适。

3 讨论

根据文献报道，鸡胚病毒增殖受孵育条件、鸡胚质量、接种技术等因素的影响[6]。不同病毒的增殖有不同的孵育条件，同一种病毒接种不同胚龄的鸡胚所获得的病毒量也不同[7]。在本试验条件下，通过血凝滴度检测结果分析可以得到：不同温度下孵育，对乙型流感病毒的复制力有着明显的影响。孵育温度越低或越高都不利于乙型流感病毒的复制，理想的孵育温度有利于乙型流感病毒的复制，提升血凝滴度，从而提高收率。乙型流感性感冒病毒在鸡胚培养的温度，各国学者曾作过研究[8-9]，认为35 ℃结果最好。本试验结果也表明，35 ℃为乙型流感病毒最佳孵育温度。

众所周知，不同病毒，其复制周期也不相同。乙型流感病毒的复制增殖需要一定的时间，才能增殖到高峰，如果孵育时间不够，病毒没有大量释放，造成血凝滴度不理想，同时考虑到如果孵育时间过长，虽然血凝滴度高且稳定，但会直接影响整个工艺的进度，因此找出最佳的孵育时间，有利于缩短制备工艺的周期，节约时间和成本，又能提高产能效率。试验结果得到，72 h为乙型流感病毒最佳孵育时间，与文献报道[10]，72 h后收获病毒结果最好相一致。

根据文献报道关于病毒增殖接种9-11 d胚龄的鸡胚为好[11]。考虑到鸡胚中的尿囊液量的多少直接影响着疫苗生产的数量和经济效益，不同胚龄的鸡胚中尿囊液量有差别。因此，在确定最佳孵育温度和时间后，通过本试验结果表明：接种胚龄小的鸡胚，尿囊液收获量不理想；接种胚龄大的鸡胚，尿囊液收获量很少；接种10-11 d胚龄的鸡胚，获得最大的尿囊液量，结果总体与文献报道相一致。同时考虑到血凝滴度结果也得比较理想，乙型流感病毒接种10 d胚龄的鸡胚最合适。

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StudyingofAppropriateIncubationConditionsofInfluenzaBVirusinDifferentEmbryonicChickenEmbryos

LI Sunhua1,JIN Liang2*

(1.Tianjin Tasly Institute,300410,Tianjin,PRC;2.Jiangxi Academy of Sciences.Institute of Microbiology,330029,Nanchang,PRC)

The appropriate incubation conditions of influenza B virus in different embryonic chicken were studied by hemagglutination assay of allantoic fluid analysis test and hemagglutination titers.The results showed that the best incubation temperature was 35 ℃ and the best incubation time was 72 h when influenza B virus strains were inoculated into 10-days-old chicken embryos. Incubation temperature and time contacted with the hemagglutination titers of influenza B virus.Furthermore,the embryo age was significantly related to the hemagglutination titer and harvest allantoic fluid.

influenza B virus;chicken embryos;culture;hemagglutination titer

2014-07-02;

2014-08-01

李孙华(1979-)，男，广西玉林人，本科，从事生物制品质量管理工作。

国家自然科学基金项目(31260031)。

10.13990/j.issn1001-3679.2014.05.014

S852.65

A

1001-3679(2014)05-0636-04

*通讯作者：靳 亮(1979-)，山东新泰人，博士，从事昆虫病毒分子生物学研究及生物农药产业化推广工作。