赵恒鑫，何树芳，王嘉福，冉雪琴

(1.贵州大学 动物科学学院，贵州 贵阳550025；2.贵州大学 农业生物工程重点实验室，贵州 贵阳，550025)

从江香猪基因组中2个拷贝数变异区的多态性研究

赵恒鑫1，2，何树芳1，2，王嘉福2，冉雪琴1*

(1.贵州大学 动物科学学院，贵州 贵阳550025；2.贵州大学 农业生物工程重点实验室，贵州 贵阳，550025)

为了研究从江香猪生长和繁殖差异与拷贝数变异拷贝数变异(copy number variation，CVN)之间的关系，采用实时荧光定量PCR方法，对从江香猪和大白猪基因组中的CNVR100与CNVR373的拷贝数进行了测定，并分析了从江香猪拷贝数与生长繁育性状之间的相关性。结果表明，从江香猪和大白猪基因组中都检测到CNVR100和CNVR373；与大白猪相比，从江香猪的CNVR100拷贝数较低，CNVR373拷贝数较高；相关性分析结果显示，从江香猪2个CNVRs与其体长和胸围有一定的负相关关系，表明这2个CNVRs的多态性可能对从江香猪的生长有一定的影响。

拷贝数变异；KIT基因；嗅觉受体；从江香猪

从江香猪是20世纪70年代末期，在贵州都柳江上游与广西壮族自治区接壤山区发现的一种小型地方猪种，其中心产区在贵州从江县的宰便、秀塘、加鸠等乡镇。经过长期的自然和人为的选择，形成了从江香猪肉质优良、耐粗饲、近交不退化等特点。香猪群体个体间的生长繁育性状的个体差异较大，3～8 月龄期间平均日增重152～186 g，窝产仔数范围为5～21 头[1-2]。近年来的研究表明，基因组中存在拷贝数变异(copy number variation，CNV)现象，并导致动物的表型发生改变[3]。CNV是2004年由Iafrate和Sebat研究小组从人类基因组中首次发现[4-5]，主要指基因组中1 kb以上的DNA片段的插入、缺失和/或扩增，及其互相组合衍生出的复杂染色体结构变异[6]。CNV的分布范围广，可以遗传，并具有高度异质性，其变异可引起基因的剂量/位置效应、发生基因的断裂或融合[7]，是与动物表型标志相关的基因组DNA多态性[8]。从江香猪群体中存在的生长繁育性状差异是否与其CNV的多态性有关，目前未见相关报道。本文选取猪8号染色体上的CNVR100、9号染色体上的CNVR373[9-10]两个CNVRs(CNV regions)，通过实时荧光定量PCR方法(Real-time quantitative polymerase chain reaction，qPCR)研究从江香猪基因组中CNVR100与CNVR373的多态性变化，探讨2个CNVRs与从江香猪生长繁育特点之间的关系。

1 材料与方法

1.1 试验动物

63头从江香猪血液样本采自从江县宰便镇、秀塘乡等地，全部香猪健康，年龄8月龄至2岁。23份大白猪血液样本采自贵州大学猪场，8～12月龄。用钢卷尺、皮尺、磅秤、测杖等测量从江香猪的体重、体高、体宽、体长、胸围、腹围、管围7项指标，调查记录乳头数和产仔数数据。

1.2 提取血液基因组

参照血液基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)说明提取基因组DNA。

1.3 PCR扩增

根据猪CNVR100及CNVR373中的保守区段使用Primer Premier 5.0设计引物(表1)，以拷贝数保守(固定为2个拷贝)的col10基因作为对照[11]，以血液基因组DNA为模板，经PCR扩增，回收目的片段，连接pGEM-T载体(Promega)，阳性克隆测序。引物合成和序列测定由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。

1.4 实时荧光定量PCR

应用SYBR试剂盒(SYBR PremixEx TaqTM，TaKaRa)进行qPCR，反应条件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，(40 个循环)；95 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，95 ℃ 15 s。

2-△Ct=2-(CtCNV-Ctcontrol)

表1 基因组qPCR引物Table 1 Primers for the genomic qPCR detection

1.5 数据分析

数据用SPSS v17.0，Pearson双侧检验方法评价CNV拷贝数与生长繁殖指标之间的相关性。

2 结 果

2.1 从江香猪体尺指标测定

测量了63头香猪的体尺(表2)。香猪体尺较小，其中体长变化范围为78～83 cm，胸围范围为75～86 cm，产仔数范围6～11头。

表2 从江香猪的体尺和部分繁殖参数测定Table 2 Indexes of body size and partial reproductive parameters of Congjiang Xiang pig

2.2 PCR扩增片段的克隆测序

以从江香猪血液基因组DNA为模板，采用特异性引物F1/R1、F2/R2、F3/R3分别进行扩增，回收扩增片段，插入pGEM-T载体中，转化大肠杆菌DH5α，阳性重组子测定核苷酸序列(图1)。经NCBI在线比对，扩增片段与已知猪参考基因组序列相应片段的相似性为100%(Scrofa 10.2)，证明扩增片段确为CNVR100、CNV373和collo基因片段。

图1 基因扩增片段序列Fig.1 Blast analysis for the sequences of amplified fragments

图2 以重组质粒为模板的标准曲线制作Fig.2 Standard curve for qPCR taking recombinant plasmid as templates

图3 qPCR 的熔解曲线Fig.3 Melting curve of qPCR

2.3 扩增效率

将重组质粒DNA稀释为100，10-1，10-2，10-3，10-4，每个稀释梯度设置三次平行检测，确定最适退火温度(表3)，测定标准曲线(图2)，计算扩增效率均在100%±10%以内(表3)。所有样品的熔解曲线均为单峰(图3)。

表3 引物的最适退火温度及扩增效率Table 3 The annealing temperature and amplification efficiency of primer pairs

2.4 从江香猪2个CNVR拷贝数检测

2.4.1 CNVR100拷贝数测定 以从江香猪基因组DNA为模板，使用特异性引物F1/R1扩增，获得69 bp的DNA片段，没有引物带(图4)。通过qPCR扩增，3次平行测定Ct值，计算CNVR100的起始模板拷贝数，得出从江香猪基因组中CNVR100的拷贝数为1.16±0.89 个，大白猪的拷贝数为2.19±0.65，经显著性检验其间差异达到显著水平(P<0.05)。

2.4.2 CNVR373拷贝数测定 使用特异性引物F2/R2，自从江香猪基因组中扩增得到108 bp的片段，没有引物带。qPCR分析，计算出CNVR373的起始模板拷贝数，从江香猪为3.36±1.09，大白猪为1.53±0.68，之间的差异达到显著水平(P<0.05)。

2.5 CNV变异与生长繁殖指标的相关性分析

将63份从江香猪样品的基因组CNVR100与CNVR373的拷贝数与其体尺和产仔数等参数之间进行相关性分析(表4)，得出从江香猪CNVR100 和CNVR373的拷贝数与其体长、胸围之间的相关系数0.25

表4 从江香猪2个CNV与其体尺和繁殖性状间的相关分析Table 4 Correlation analysis of two CNVs with the body size and reproduction traits in Congjiang Xiang pig

注：a代表在0.05水平差异显著。

Notes: Letter “a”means significant difference at 0.05 level.

图4 血液基因组样品CNV的qPCR检测

3 讨 论

3.1 CNVR100拷贝数与香猪生长繁育性状之间的关系

自从江香猪和大白猪血液基因组DNA中检测到CNVR100存在拷贝数变异，从江香猪CNVR100的拷贝数范围为1～8 个拷贝，平均1.16±0.89 个，大白猪的拷贝数为2.19±0.65。以往的研究表明，杜洛克、荣昌猪CNVR100的拷贝数为1～8个[12]，与本文的研究结果相近。

相关性分析结果显示，从江香猪的CNVR100拷贝数与其体长、胸围之间为弱的负相关关系。CNVR100位于猪基因组中第8条染色体(35580750-36119848)，总长共有539099 bp[9]，其中包含的唯一的基因是KIT。KIT为原癌基因，编码干细胞生长因子受体(mast/stem cell growth factor receptor MGF/SGF)，干细胞因子(stem cell factor，SCF)与KIT结合，调节造血干细胞、消化道细胞、肥大细胞、生殖细胞等的生长发育和分化，对个体的生长发育起多方面的调节作用[13]。从江香猪基因组CNVR100的拷贝数低于大白猪的相应值。从江香猪的体长、胸围明显低于大白猪，大白猪180日龄体长平均为101.54 4.97 cm，胸围平均为96.60 4.46 cm[14]。提示CNVR100的低拷贝可能影响从江香猪的体长和胸围的生长。

3.2 CNVR373拷贝数与香猪生长繁育性状间的关系

经检测，从江香猪和大白猪血液基因组DNA中存在CNVR373的变异，实验得出从江香猪CNVR373拷贝数的平均值为3.36±1.09，大白猪为1.53±0.68，二者之间的差异显著(P<0.05)。CNVR373位于猪9号染色体上(4203824-4364337)，区域全长160513 bp[10]，该区域中含有的基因均为嗅觉受体基因。从江香猪的CNVR373拷贝数高于大白猪，可能是从江香猪的嗅觉较为灵敏的原因之一。由CNVR373拷贝数与体尺和部分繁殖指标间的相关性分析可知，CNVR373拷贝数与从江香猪的体长、胸围有弱的负相关关系。结合从江香猪的体长和胸围明显小于大白猪，提示CNVR373拷贝数较高可能参与从江香猪的体长和胸围的生长调节。

本文的研究结果表明，从江香猪基因中存在CNVR100和CNVR373变异；与大白猪相比，从江香猪基因组中CNVR100的拷贝数较低，香猪的CNVR373拷贝数较高，并与从江香猪的体长和胸围有一定的负相关关系，这两个CNVR对从江香猪的生长和发育可能有一定的调节作用。

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PolymorphismofTwoCNVsintheGenomeofCongjiangXiangPiginGuizhou

ZHAO Heng-xin1，2,HE Shu-fang1，2,WANG Jia-fu2,RAN Xue-qin1*

(1.FacultyofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,GuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550025,China；2.KeyLaboratoryforAgriculturalBioengineeringofGuizhouProvince,Guiyang，Guizhou550025,China)

To investigate the polymorphism of copy number variation(CNV) and its relationship with growth and reproduction of Congjiang Xiang pig,two CNVR numbers of Congjiang Xiang pig were determined by real-time quantitative polymerase chain reaction(qPCR),taking Yorkshire pig as control.The results showed that both of CNVR100 and CNVR373 were detected from the genome of Congjiang Xiang and Yorkshire pig breeds.The copy numbers of CNVR100 was lower and CNVR373 copies was higher in Congjiang Xiang pig than that in Yorkshire.Further more,copies of two CNVRs were weakly negatively correlated with the value of body length and chest circumference of Congjiang Xiang pig.The results suggested that both of two CNVs,CNVR100 and CNVR373,might effect on the growth of body trunk and chest in Congjiang Xiang pig.

copy number variation;KIT gene;olfactory receptor;qPCR;Congjiang Xiang pig

2013-12-28，

2014-01-14

国家“863”课题(2013AA102503)，国家科技支撑计划(2008BADB5B02)，贵州省农业攻关项目(黔科合NY[2013]3073)

赵恒鑫(1988-)，男，山东蓬莱人，硕士生，研究方向：动物生理与分子生物学。E-mail: zmshyx@aliyun.com

*[通讯作者]冉雪琴(1967-)，女，重庆忠县人，教授，研究方向：动物生理与分子生物学。E-mail：as.xqran@gzu.edu.cn

S811.6

A

1005-5228(2014)09-0019-04