杨继要,冯 若,金 辉,孙 芸,丁 一

郑州大学基础医学院组织学与胚胎学教研室 郑州 450001

混合血清孵育的肺腺癌组织双向蛋白印迹图谱的建立*

杨继要,冯 若,金 辉,孙 芸,丁 一#

郑州大学基础医学院组织学与胚胎学教研室 郑州 450001

#通讯作者，男，1963年10月生，博士，教授，研究方向：肿瘤生物学，E-mail：dingyi@zzu.edu.cn

肺腺癌；混合血清；双向蛋白印迹图谱

目的：建立混合血清孵育的肺腺癌组织双向蛋白印迹图谱。方法收集2例肺腺癌患者的手术标本，提取癌组织可溶性总蛋白并双向凝胶电泳分离，将蛋白转移到硝酸纤维素膜上，然后分别与4例肺腺癌患者的混合血清和4例良性肺部疾病患者(对照)的混合血清孵育2 h，再加入二抗羊抗人IgG反应2 h，DAB显色。结果分别建立了肺腺癌混合血清和对照混合血清孵育的肺腺癌组织双向蛋白印迹图谱，两个图谱之间存在明显差异。结论利用混合血清孵育的肺腺癌组织总蛋白能建立良好的双向蛋白印迹图谱，这为进一步鉴定肺腺癌肿瘤相关抗原奠定了基础。

肺癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤之一，早期诊断是提高肺癌生存率的关键，对改善肺癌预后具有重要意义[1]。从肿瘤免疫学来看，肿瘤细胞是“非己细胞”，总是或多或少地表达区别于正常细胞的肿瘤抗原，因而在患者血清中极有可能存在相应的抗体[2-3]。肿瘤血清蛋白质组学分析方法是蛋白质组学和肿瘤免疫学结合的方法[4]，该方法结合蛋白质组学能同时分离肿瘤组织(细胞)大量蛋白质的优势和免疫反应高度特异性的特点，可快速筛选出与肿瘤免疫密切相关的蛋白质，进而鉴定出肿瘤的分子标志物。该方法为寻找新型肺癌早期诊断指标提供了有效途径[4]。蛋白质双向电泳技术是目前蛋白质组学研究中分离蛋白质的核心方法[5]。作者应用混合血清孵育肺腺癌组织，建立肺腺癌组织双向蛋白印迹图谱，为进一步筛选和鉴定肺腺癌肿瘤相关抗原打下基础。

1 材料与方法

1.1样本来源4例肺腺癌、4例良性肺部疾病患者血清和2例经病理学鉴定为肺腺癌的手术标本均取自郑州大学第一附属医院。

1.2主要试剂与设备IPG预制干胶条(pH5～8，11 cm)、尿素、硫脲、矿物油、两性电解质(Bio-lyte Ampholyte 3-10)、双向电泳系统(Protean IEF Cell等电聚焦仪，Protean ⅡXi Cell垂直电泳仪)及Gs-800图像获取仪均为BioRad公司产品,四甲基乙二胺、Tris-Base、碘乙酰胺、CHAPS、二硫苏糖醇(DTT)、抑肽酶均为Sigma公司产品，孔径0.22 μm硝酸纤维素膜购自Millipore公司，辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG和DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术服务有限公司。

1.3肺腺癌组织可溶性总蛋白的提取及浓度测定

用消毒剪刀将肺腺癌组织块剪碎后，放入组织匀浆器中，加入组织裂解液(7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，40 g/L CHAPS，100 mmol/L DTT，2 g/L两性电解质，0.5 mmol/L EDTA，1 mg/L抑肽酶)，在冰上充分研碎组织，BradFord标准曲线法测定样品的蛋白质浓度。

1.4双向蛋白印记图谱的建立取11 cm的IPG预制干胶条数条，胶面向下分别放置于电聚焦盘中不同泳道的蛋白样品溶液上，开始第一向等电聚焦电泳，程序如下：50 V主动水化16 h，250 V除盐1 h，1 000 V除盐1 h，升压5 h至10 000 V，聚焦至40 000 Vh完成；第二向SDS-PAGE电泳条件如下：压缩电流10 mA/胶，分离电流30 mA/胶。双向电泳完成后，裁与凝胶大小相符的硝酸纤维素膜对凝胶进行转膜，转膜后将硝酸纤维素膜置于丽春红染液染色数秒，验证转膜效果。取4例肺腺癌患者的血清，每例取500 μL，混合为2 mL，按19的比例加入18 mL的封闭液混合；4例良性肺部疾病患者(对照)的血清按同样方法处理。将2张硝酸纤维素膜分别放入肺腺癌患者和对照血清中室温孵育2 h，然后，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG室温反应2 h，DAB显色。

2 结果

2.1双向凝胶转膜效果双向凝胶转膜完成、丽春红染色后，膜上能看到大、中、小相对分子质量范围内的蛋白质点，证明双向凝胶转膜效果较好(图1)。

图1 双向凝胶转膜后的丽春红染色图

2.2双向蛋白印记图谱见图2、3。通过比较可以看出，二者之间存在明显差异。以两种图谱中均可以找到的A、B、C 3点作为标志点，肺腺癌图谱中，A点左下方、B点右下方、BC点连线上方的区域中均有Western blot反应蛋白的存在，而对照图谱中则没有。

图2 肺腺癌患者混合血清孵育的肺腺癌组织双向蛋白印迹图谱

图3 良性肺部疾病患者混合血清孵育的肺腺癌组织双向蛋白印迹图谱

3 讨论

肿瘤血清蛋白质组学分析方法结合了蛋白质组学和肿瘤免疫学的优势。利用双向蛋白印迹技术分离肿瘤和正常组织蛋白，筛选差异表达蛋白，可为筛选和鉴定肿瘤相关抗原打下基础[6]。在应用肿瘤血清蛋白质组学分析方法建立其他肿瘤蛋白印迹图谱的研究中，通常采用单个血清(按50～100倍稀释)孵育硝酸纤维素膜[7-9]，该实验中作者采用混合血清作为一抗对承载肺腺癌组织总蛋白的硝酸纤维素膜进行孵育。选用混合血清而不是单个血清主要是出于以下考虑：首先，由于个体间存在差异，并不是每个患者都会产生针对某种抗原的抗体并出现在血清中，如果每例血清都做孵育的话，势必增加实验次数，而双向电泳及转膜次数越多，误差也就越大，可能会造成蛋白质在凝胶和硝酸纤维素膜上的位置发生变化，原本相同的反应点因位置变化，可能被认定为不同的反应点，增加了蛋白质点比对的难度；再者，从每个患者取得的化疗前血清标本有限，而孵育较大的双向硝酸纤维素膜需要较多的一抗孵育液，单个患者的血清不能彻底浸泡双向硝酸纤维素膜；最后，混合血清的使用由于减少相同实验的次数而可以降低实验成本。基于以上几点原因，作者采取4例肺腺癌患者血清各0.5 mL混合，加入18 mL的封闭液，使总血清与总体积的比值为110(单个血清与总体积的比值常为140)，在这个比值范围内，各血清内若有共同的抗体存在则可以充分与硝酸纤维素膜上的蛋白质点反应，而每个血清中的个体特异性抗体也可与其相应的抗原反应，而且所有反应的蛋白质点显示在同一张膜上，使差异蛋白质点的软件分析和人工比对工作更为容易。该研究中，作者制备了用肺腺癌患者混合血清和良性肺部疾病患者的混合血清，分别与2例肺腺癌组织总蛋白反应，建立了双向蛋白印迹图谱，通过比对两个图谱找到只与肺腺癌血清反应的差异点，这为下一步筛选和鉴定肺腺癌肿瘤相关抗原打下了实验基础。

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[2]Desmetz C,Mange A,Maudelonde T,et al.Autoantibody signatures: progress and perspectives for early cancer detection[J].J Cell Mol Med,2011,15(10):2013

[3]Akerley WL,Nelson RE,Cowie RH,et al.The impact of a serum based proteomic mass spectrometry test on treatment recommendations in advanced non-small-cell lung cancer[J].Curr Med Res Opin,2013,29(5):517

[4]Li C,Xiao Z,Chen Z,et al.Proteome analysis of human lung squamous carcinoma[J].Proteomics,2006,6(2):547

[5]柴玉荣，刘国红，崔柳青，等.杜氏盐藻高盐诱导蛋白的分离和鉴定[J].郑州大学学报：医学版，2011，46(1)：16

[6]刘国红，杨继要，呼琳，等.胃腺癌及正常胃黏膜组织蛋白质组双向电泳图谱分析[J].郑州大学学报：医学版，2009，44(4)：786

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(2013-03-27 收稿 责任编辑 王 曼)

Establishment of 2-dimensional Western blot maps of lung adenocarcinoma incubated with mixed sera

YANGJiyao，FENGRuo，JINHui，SUNYun，DINGYi

DepartmentofHistologyandEmbryology，CollegeofBasicMedicalSciences，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

lung adenocarcinoma;mixed sera; 2-dimensional Western blot map

Aim: To establish the 2-dimensional Western blot maps of lung adenocarcinoma incubated with mixed sera. Methods: The soluble proteins of lung adenocarcinoma tissue samples from 2 patients were extracted and separated by 2-dimensional electrophoresis, then transferred onto nitrocellulous membranes. After having reacted with mixed sera from 4 lung adenocarcinoma patients or 4 patients with benign lung disease for 2 h, respectively, the nitrocellulous membranes were incubated with goat anti human IgG as the second antibody for 2 h, then DAB kit revealed the results of reaction. Results: 2-dimensional Western blot maps of lung adenocarcinoma incubated with mixed sera from lung adenocarcinoma and benign lung disease patients were established successfully, and the differences between the two maps were showed. Conclusion: The excellent 2-dimensional Western blot maps of lung adenocarcinoma incubated with mixed sera can be built up, which will lay the foundation for the following identification of tumor-associated antigens in lung cancer.

*河南省医学科技攻关计划项目 200903005

R734.2

10.3969/j.issn.1671-6825.2014.01.013