强 薇，郭 帅，张爱华，雷锋杰，匙 坤，王 壮，王二欢，张连学

(吉林农业大学 中药材学院, 吉林 长春 130118)

人参根际土壤中拮抗人参病害微生物的筛选

强 薇，郭 帅，张爱华，雷锋杰，匙 坤，王 壮，王二欢，张连学

(吉林农业大学 中药材学院, 吉林 长春 130118)

【目的】筛选对人参主要病原菌拮抗率更高、抑菌谱更广的新菌株生防菌种资源.【方法】稀释平板法分离拮抗菌；平板对峙法筛选拮抗菌.【结果和结论】筛选出对人参单一病原菌有高拮抗活性的放线菌7株，对人参疫病、菌核病、灰霉病、黑斑病、锈腐病、立枯病、根腐病拮抗率分别为80.84%、82.46%、66.08%、71.33%、64.63%、85.53%、65.11%，其中对7大人参病害均有高拮抗活性的菌株有5株，包括1株木霉菌、4株放线菌.研究结果表明，可利用人参根际土壤中的有益菌研究其生防潜力，用于人参主要病害的防治.

菌株筛选； 拮抗菌； 人参; 病原菌； 根际微生物

人参PanaxginsengC. A. Mey为五加科名贵中药材，需要种植5～6年才能收获.人参病害主要以根部病害为主，也伴有一些地上茎叶的病害，根部病害发病率20%左右，重者高达70%以上，严重影响了人参的产量和品质，削弱了我国人参产品在国际市场上的竞争力[1].目前我国人参病害主要依靠化学杀菌剂防治，杀菌剂在土壤中的有效期为1个月左右，容易造成化学农药污染.利用微生物拮抗菌株防治人参病害可以1次施用，多年有效，对人参和周边环境不会造成化学残留，是人参病害防治的发展方向[2-5].

我国在人参病害拮抗菌筛选方面做了较多工作，得到了一些对人参病害有拮抗作用的有益菌株[6]，并且取得了较好的防治效果[7- 8]，但是，这些拮抗菌大多数只作用于1种人参病害、或是同时作用于2～3种人参病害，不能满足实际防治需要，防治效果也不很理想.本试验从我国人参主产区的人参根际土壤中进行了大量拮抗菌的筛选，以期分离出拮抗效果更好、抑菌谱更广、同时对7大人参主要病害有抑制作用的优良菌株，从而扩大生防菌种资源，为开发防治人参病害杀菌剂提供基础.

1 材料与方法

1.1 材料

培养基：放线菌的分离培养采用高氏一号培养基；木霉菌的分离培养采用孟加拉红培养基；拮抗菌筛选采用PDA培养基.

人参病原菌：疫病菌Phytophthoracactorum、菌核菌Sclerotiniaschinseng、灰霉菌BotrytiscinereaPers、黑斑菌Alternariapanax、锈腐菌Cylindrocarpondestructans、立枯菌Rhizoctoniasolani、根腐菌Fusariumsolani，由吉林农业大学人参研究工程中心实验室提供.

土样：集安(3、4、5年生)、靖宇(4、5年生)、抚松(4、5、6年生)、长白(5、6、7年生)等人参主产地的不同年生人参根际土壤，2次采样时间分别为2012年5月和9月，共采集土样58份，4℃冰箱保存备用.

木霉菌：sTHB和sTV04，由吉林农业大学人参研究工程中心实验室提供.

1.2 方法

1.2.1 拮抗菌的分离 采用稀释平板法对土壤中的微生物进行分离，取0.5 mL相应稀释浓度的菌悬液用涂布棒分别涂到对应的培养基上，置于恒温培养箱内培养，待菌落形成后，挑取不同形态的单菌落，纯化后保存.其中，木霉菌稀释度为10-3、10-4、10-5，25 ℃培养24～48 h；放线菌的稀释度为10-3、10-4、10-5,28 ℃培养48～72 h；每个稀释度重复3次.

1.2.2 拮抗放线菌的筛选 将人参病原菌用打孔器制成直径为5 mm的菌块接种于中心，挑取放线菌在距离中心等距离的两侧划线.以只接病原菌的PDA平板作为对照，每处理重复3次.28 ℃培养箱中培养72～84 h后，初步筛选出对人参病原菌有拮抗作用的菌株，将这些拮抗菌株纯化，保存，待测.

1.2.3 拮抗木霉菌的筛选 将人参病原菌和拮抗菌株分别用打孔器制成直径为5 mm的菌块，并将人参病原菌和拮抗菌分别接种于距中心等距离的PDA平板的两侧.以只接病原菌的PDA平板作为对照，每处理重复3次.25 ℃培养箱中培养72～84 h后，初步筛选出对人参病原菌有拮抗作用的菌株，将这些拮抗菌株纯化、保存、待测.

1.2.4 拮抗放线菌的抑菌活性测定 将有抑菌作用的拮抗菌株做进一步筛选.在PDA培养皿中心接种培养48 h的人参病原菌菌饼(直径5 mm)，用接种针蘸取培养48 h的拮抗菌，以病原菌菌饼为中心，在PDA培养基上划等边三角形，这3条细线的竖行作为3次重复数据，以只接种病原菌的PDA平板为对照，28 ℃培养72～96 h左右，待对照接近长满培养皿时，用游标卡尺测量各个培养皿中人参病原菌的菌落生长半径，按下面公式计算拮抗率：

拮抗率=(对照病原菌净生长半径-拮抗菌作用后的病原菌净生长半径)/对照病原菌净生长半径×100%.

1.2.5 拮抗木霉菌抑菌活性测定 采用两点对峙法(方法同1.2.2)，25 ℃培养箱中培养72～84 h后，待对照接近长满平板时，用游标卡尺测量各个培养皿中人参病原菌的菌落生长半径，计算拮抗率.

1.3 数据分析

Excel 2003录入数据，DPS 7.05软件进行方差分析，LSD法进行多重比较.

2 结果与分析

2.1 拮抗菌的分离和对7种人参病原菌的拮抗作用

从土壤中分离得到226株放线菌、35株木霉菌，其中筛选出有拮抗作用的放线菌25株、木霉菌8株.而其余的201株放线菌和27株木霉菌没有拮抗作用(表1).

表1拮抗菌对人参疫病、菌核、灰霉、黑斑病、锈腐、立枯、根腐病病原菌的拮抗率

Tab.1TheantagonisticrateofantagonisticstrainsonpathogensofPhytophthoracactorum,Sclerotiniaschinseng,Botrytiscinerea,Alternariapanax,Cylindrocarpondestructans,RhizoctoniasolaniandFusariumsolani

1)首字母A、B为放线菌；首字母m为木霉菌.

对人参疫病病原菌有拮抗作用的放线菌有21株、木霉菌5株；拮抗率均达到40%以上.放线菌A-A- 26-1对其拮抗率最高(80.84%)；木霉菌mB153对其拮抗率最高(78.68%).对人参菌核病病原菌有拮抗作用的放线菌有9株、木霉菌1株；拮抗率达到40%以上.放线菌A-34对其拮抗率最高(82.46%)；木霉菌mB153对其拮抗率最高(41.39%).对人参灰霉病病原菌有拮抗作用的放线菌有8株、木霉菌1株；拮抗率达到10%以上.放线菌A-38对其拮抗率最高(66.08%)；木霉菌mB153对其拮抗率最高(71.76%).对人参黑斑病病原菌有拮抗作用的放线菌有23株、木霉菌1株；拮抗率达到30%以上.放线菌B- 4对其拮抗率最高(71.33%)；木霉菌mB153对其拮抗率最高(71.76%).对人参锈腐病病原菌有拮抗作用的放线菌有22株、木霉菌6株；拮抗率达到10%以上，放线菌A-30对其拮抗率最高(64.63%)；木霉菌mB153对其拮抗率最高(80.56%).对人参立枯病病原菌有拮抗作用的放线菌有5株、木霉菌1株；拮抗率达到50%以上，A- 47对其的拮抗率最高(85.53.%)；木霉菌mB153对其拮抗率最高(76.90%).对人参根腐病病原菌有拮抗作用的放线菌有28株、木霉菌2株；拮抗率达到10%以上，B-11- 45对其拮抗率最高(65.11%)；木霉菌mA-11对其拮抗率最高(49.81%).

2.2 拮抗菌株对7种人参病原菌的拮抗活性测定

4株高活性拮抗放线菌A-38、A-34、A-39、A- 47(表2、图1)和1株高活性拮抗木霉菌株mB153(图2)均同时对7种人参病原菌有较高的拮抗作用.其中，对人参疫病病原菌拮抗率最高的拮抗菌株是放线菌A-39(71.0%)；对人参菌核病病原菌拮抗率最高的拮抗菌株是放线菌A-34(82.4%)；对人参灰霉病病原菌拮抗率最高的拮抗菌株是放线菌A-38(66.0%)；对人参黑斑病病原菌拮抗率最高的拮抗菌株是放线菌A- 47(65.3%)；对人参锈腐病病原菌拮抗率最高的拮抗菌株是放线菌A- 47(48.2%)；对人参立枯病病原菌拮抗率最高的拮抗菌株是放线菌A- 47(85.5%)；对人参根腐病病原菌拮抗率最高的拮抗菌株是放线菌A-38(59.6%)；A- 25、A-30、A- 61、A-50、A-19拮抗放线菌同时对2种及2种以上的人参病原菌有不同程度的抑制作用.

表2 拮抗放线菌对7种人参病原菌的抑制作用1)Tab.2 The inhibition of antagonistic activity of Actinomyces on 7 ginseng pathogens %

1) 同行数据后凡具有一个相同小写字母者表示差异不显著(P>0.05，LSD法).

a、b分别表示放线菌A- 47和A-39对人参黑斑病病原菌的拮抗效果；c：放线菌A-38对人参根腐病病原菌的拮抗效果；d：放线菌A-34对人参疫病病原菌的拮抗效果.

图1 高活性菌株对人参病原菌的拮抗作用
Fig.1 Antagonistic effects of high activity strains on pathogens of ginseng

a、b、c、d分别表示木霉mB153对人参锈腐病、人参黑斑病、人参菌核病、人参根腐病病原菌的拮抗效果.

图2 高活性拮抗木霉mB153对人参病原菌的拮抗效果

Fig.2 The antagonistic effect of a high antagonistic activityTrichodermamB153 on ginseng pathogens

3 讨论与结论

人参病害从发生部位可以分为地上、表土中和地下部位.黑斑病、疫病、灰霉病属于地上部位病害，立枯病属于表土中的病害，锈腐病、根腐病、菌核病都属于根部病害[9].邢云章等[10]研究发现绿色木霉菌对人参根腐病病原菌有抑制作用，本试验筛选出1株绿色木霉菌mB153对人参根腐病病原菌也有抑制作用.王慧等[11]从79 株木霉菌株中筛选出3株对人参锈腐病病原菌拮抗效果较好的菌株WCT- 01、WWZ22-11和Z- 67，3株木霉菌抑制率分别达到77.24%、76.08%和74.06%.ECT- 01- 2对人参锈腐病病原菌的抑制率高达83.68%[12].而本试验筛选的高活性木霉菌株(mB153)对人参锈腐病病原菌的抑制率达到80.56%.崔立萍等[13]研究筛选的5株拮抗菌对人参黑斑病病原菌的抑菌率达到70%～80%，而本试验筛选得到的4株高活性拮抗放线菌(A-38、A-34、A-39、A- 47)、1株木霉(mB153)对人参黑斑病、人参锈腐病的抑制率均达到50%和38%以上，而且这5株高活性拮抗放线菌均对7大人参主要病害有较高的拮抗作用，与前人的研究相比较，这5株高活性拮抗菌的抑菌谱更宽，能同时降低多种人参病害的发生率，更能满足人参多种病害同时发生的实际防治需要，具有巨大的应用开发潜力.研究[14-16]发现一些有益绿色木霉、细菌的拮抗菌株同时对人参锈腐病、立枯病、疫病、黑斑病、灰霉病、根腐病、菌核病等常见人参病害有较高拮抗作用，但本试验筛选的拮抗菌的抑菌谱更宽.本试验筛选出的拮抗放线菌数量更多，而木霉菌拮抗率更高.

从微生物农药的成分上来看，单一的微生物杀菌剂的拮抗效果往往不好，表现在定植效果不好和使得病原菌产生抗性等方面；而采用复配、多种拮抗菌剂混合、添加有机添加剂[17]等方式更符合人参病害防治的实际需要.本试验中筛选的拮抗木霉菌株mB153对7大人参病害均有不同程度抑制作用，其中对人参锈腐病病原菌的拮抗率最高为：80.56%，对菌核病病原菌的拮抗率最低为：41.39%，对其他5种人参病原菌的拮抗率达41.39%～80.56%.供试木霉菌株sTHB对7大人参病害均有不同程度拮抗作用，对人参黑斑病病原菌的拮抗率最高为：83.58%，对人参菌核病病原菌的拮抗率最低为：53.83%，对其他5种人参病原菌的拮抗率均在53.83%～83.58%.供试木霉菌株sTV04对人参锈腐病病原菌拮抗率最高为：84.67%，对人参菌核病病原菌的拮抗率最低为48.35%，但对人参疫病病原菌无抑制作用，而对其他4种人参病原菌的拮抗率均在48.35%～84.67%.本试验筛选出的拮抗菌株mB153对人参病原菌的拮抗率虽然低于实验室供试菌株，但是仍然具有一定的应用防效价值.研究发现实验室保存的木霉菌sTHB、sTV04和本试验筛选的拮抗木霉菌株mB153对人参菌核病病原菌均表现出最低的拮抗率，可以考虑将3种木霉菌制成混合剂型的微生物杀菌剂，以期能更好的防治人参菌核病.本试验的拮抗菌均分离自人参根际土壤，这一点，对于后续菌株的定植会占有一定优势，这与Timmusk等[18]研究结果是类似的，因此具有很好的研究和开发前景.关于拮抗菌株的鉴定、生防制剂、抗菌活性物质的分离纯化和结构鉴定以及生防菌株的混合使用技术还需要进一步研究.

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【责任编辑霍 欢】

ScreeningantagonisticmicroorganismsagainstginsengdiseasesfromPanaxginsengrhizospheresoil

QIANG Wei, GUO Shuai, ZHANG Aihua, LEI Fengjie, CHI Kun, WANG Zhuang, WANG Erhuan, ZHANG Lianxue

(College of Chinese Traditional Medicine, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

【Objective】 To expand biocontrol strain resources and screen new strains with a higher antagonistic rate and a wider inhibiting range to control ginseng diseases. 【Method】 The antagonistic strains were isolated by dilution plate method and were screened by flat-stand method.【Result and conclusion】 Seven actinomycetes strains with higher antagonistic activities to single ginseng pathogen, such asPhytophthoracactorum,Sclerotiniaschinseng,Botrytiscinerea,Alternariapanax,CylindrocarpondestructansRhizoctoniasolaniandFusariumsolani, had been screened, whose inhibition rates were 80.84%, 82.46%, 66.08%, 71.33%, 64.63%, 85.53% and 65.11%, respectively. Five strains, including a strain ofTrichodermaand four strains ofActinomyces, had higher antagonistic activities to seven kinds of ginseng pathogens. The results indicate that the beneficial strains in the rhizosphere has a biocontrol potential ability of ginseng pathogens and can be used to prevent and cure major diseases of ginseng.

screen strains; antagonist strain; ginseng; pathogen; rhizosphere microbial

2013- 11- 28优先出版时间2014- 07- 17

优先出版网址：http:∥www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.S.20140717.0907.014.html

强 薇(1986—)，女，硕士研究生，E-mail: 1263785469@qq.com：通信作者：张连学(1955—)，男，教授，博士，E-mail: zlx863@163.com

国家自然科学基金(31070316，31100239，31200224); 国家“十一五”科技支撑计划子课题(2006BA109804- 02)； 国家公益性行业科研专项(201303111)；吉林省科技发展计划项目(20110926，20130206030YY)

强 薇，郭 帅，张爱华，等.人参根际土壤中拮抗人参病害微生物的筛选[J].华南农业大学学报，2014,35(5):76- 81.

S482.292

A

1001- 411X(2014)05- 0076- 06