戢志呈，江雁翔，刘耀光，张群宇

(亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室/华南农业大学 生命科学学院，广东 广州 510642)

应用Gibson Assembly方法构建植物表达载体

戢志呈，江雁翔，刘耀光，张群宇

(亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室/华南农业大学 生命科学学院，广东 广州 510642)

【目的】构建方便快捷的植物表达载体.【方法】应用Isothermalinvitrorecombination system or “Gibson Assembly”方法设计包含片段间20～25 bp互补重叠序列的引物，通过PCR扩增出带有首尾重叠的目的DNA片段，可将1个或多个片段和线性化的载体一步组装成表达载体.【结果和结论】 利用该方法快速构建了多个水稻基因的全长以及部分缺失编码区表达载体.此外，还通过对Gibson Assembly连接产物进行PCR扩增后再连接到载体，提高多DNA片段组装的效率.本方法不受目的片段内部限制性酶切位点的限制，可广泛应用于各种载体的构建.

Gibson Assembly； 体外重组； 植物表达载体构建

表达载体是研究目的基因功能和遗传工程的重要工具，在亚细胞定位、目的基因表达、基因敲除、酵母双杂交和单杂交、T-DNA插入突变等技术方法中广泛应用.传统载体的构建基于限制性内切酶和T4DNA连接酶的方法,它要求先从细胞或组织中分离目的基因的DNA片段，然后利用限制性内切酶切断双链DNA分子从而产生黏性末端或平末端.如果线性化载体也产生相同的末端，二者可以在T4DNA连接酶作用下重新形成磷酸二酯键，构成一个完整的DNA分子[1].此方法操作容易、但针对多个片段的连接，则需要进行多……