龙翔宇, 蒲至恩, 杨丽娟, 郑 科, 刘泽厚

(1 中国热带农业科学院 橡胶研究所，海南 儋州 571737； 2 四川农业大学 小麦研究所，四川 成都 611130)

小麦胁迫相关基因TaLEA2的克隆、生物信息学及表达特性分析

龙翔宇1, 蒲至恩2, 杨丽娟2, 郑 科2, 刘泽厚2

(1 中国热带农业科学院 橡胶研究所，海南 儋州 571737； 2 四川农业大学 小麦研究所，四川 成都 611130)

【目的】克隆小麦Triticumaestivum晚期胚胎发育丰富蛋白基因并对其进行基因结构、蛋白特性及表达模式分析，为其耐盐性研究奠定理论基础.【方法】搜索小麦EST数据库，通过同源克隆分离并获得小麦晚期胚胎发育丰富蛋白基因，用生物信息学软件分析该基因结构及蛋白特性，荧光定量试验分析该基因的表达模式.【结果和结论】获得1条1 100 bp的核苷酸序列，该序列包含了1个981 bp的开放阅读框，编码1个由326个氨基酸残基组成的蛋白，该蛋白含有2个LEA2结构域，属于第2组LEA蛋白，该蛋白命名为TaLEA2.生物信息学分析显示TaLEA2蛋白具有LEA2家族的典型特征，富含赖氨酸(Lys)，不含半光氨酸(Cys)，无明显的高级结构，平均亲水系数(GRAVY)为-0.405，稳定系数为25.28，这种氨基酸组成及结构均有利于蛋白的热稳定性及亲水性.实时荧光定量PCR分析表明，TaLEA2基因为组成型表达，同时该基因存在组织表达差异，且表达受不同发育时期影响；该基因调控表达受高盐、低温、病原菌及干旱等胁迫的影响，尤其在干旱胁迫中上调表达明显，但该基因不受外源ABA刺激的影响.推测TaLEA2基因参与了小麦正常条件下的生长发育，同时也广泛地参与了小麦抵御逆境胁迫的响应，尤其在小麦的抗旱胁迫过程中发挥重要作用.

小麦；TaLEA2 基因； 基因克隆； 生物信息学； 基因表达

植物在低温、干旱和盐泽等逆境条件下，会产生一系列具有保护功能的蛋白来维持其正常的生命代谢活动，胚胎发育晚期丰富蛋白(Late embryogenesis abundant proteins，LEA蛋白)就是其中的一种，它被认为是与植物抗逆反应相关的一类重要蛋白[1].LEA蛋白首先在植物中被发现，是植物胚胎发生后期种子中大量积累的一类亲水蛋白，该类蛋白不仅广泛地存在于高等植物的种子、幼苗及成年植株中，同时也存在于细菌、真菌和动物中[2].LEA蛋白是一类亲水性大家族，同时具有很高的热稳定性，即使在煮沸条件下也能保持水溶状态[3].根据保守结构域及亲水系数等，Battagliad等[4]将LEA蛋白分为7个家族.在干旱、高低温、盐泽和重金属胁迫条件下，LEA蛋白具有稳定细胞膜、清除活性氧自由基、结合金属离子等功能，从而对植物起保护作用[5].

根据报道[6-7]，脱水素(第2组LEA)在植物因干旱失水时，能够代替水分子，保持细胞液体处于溶解状态，从而避免细胞结构的塌陷，稳定细胞结构，尤其是膜结构，同时该组蛋白可能起到了分子伴侣和亲水性溶质的作用，在水分胁迫时稳定和保护蛋白质的结构及功能.Danyluk等[8]认为脱水素对逆境胁迫保护小麦膜系统稳定性至关重要.大麦中的脱水素DHN4、DHN6在干旱胁迫影响中发挥重要功能，随后发现青稞中的DHN4在抗旱能力方面起到了重要的作用[9-11].脱水素在植物抵御金属离子、高低温等胁迫的过程中也发挥着重要的作用.Zhang等[12]在菜豆中分离并获得SKn型脱水素，研究发现SKn型脱水素具有响应重金属胁迫的功能.在烟草中过量表达柑橘脱水素Cucor19，发现可以增强烟草对低温的抗性，并且可以抑制质膜过氧化[13].目前关于小麦脱水素基因的克隆及其功能的报道还不多见.本研究根据小麦EST数据库，筛选抗旱候选基因序列，克隆并获得TaLEA2的cDNA序列，对该基因编码的蛋白序列进行了生物信息学分析，采用荧光定量PCR技术分析了该基因的表达特征，推测TaLEA2参与小麦正常条件下的生长发育，同时参与小麦抵御逆境胁迫的响应，尤其在小麦的抗旱胁迫过程中发挥重要作用.

1 材料与方法

1.1 材料及处理

本试验使用的材料是六倍体普通小麦Triticumaestivum中国春.选取籽粒饱满的小麦种子用流水冲洗干净后播种于装有干净石英砂的塑料盆内，每盆3粒，然后将其放置到Hoagland营养液中进行水培，每隔24 h更换1次营养液，在光照培养箱中培养大约3周后，待其长到二叶一心后，选择长势基本一致的材料进行处理，每个试验处理设有3个重复.处理1：将待处理材料放入含有200 mmol·L-1NaCl的Hoagland营养液中诱导48 h，取其根及叶片；处理2：将待处理材料放入含有50 mmol·L-1ABA的Hoagland营养液中激素诱导48 h，取其根及叶片；处理3：将待处理材料放入含有150 mmol·L-1PEG的Hoagland营养液中干旱诱导48 h，取其根及叶片；处理4：低温(4 ℃)诱导24 h，取其叶片；处理5：供试菌为条中32，购于甘肃省农业科学院，采用抖粉接种方法，接种时先往接种点喷水雾，然后将菌粉(新鲜孢子与滑石粉质量比1∶250混合)抖落到麦叶上，接种后再喷1次水，盖上塑料薄膜，于15 ℃黑暗培养12 h后，将薄膜取下正常生长，72 h后取其叶片；对照与处理采样时间同步.

1.2 RNA提取、cDNA合成及TaLEA2的克隆

利用Trizol试剂盒提取不同材料的总RNA(购自天根生化科技有限公司)，反转录采用PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒(购自宝生物工程有限公司)，提取及合成方法按照试剂盒说明书进行.

分析小麦EST数据库(HAWheat152)，筛选并拼接小麦胁迫候选基因，根据找到的TaLEA2(ACCESSION，AK330667)序列设计引物(TaLEA2-F1：5′-CCACTTTCCATCTCATCTCG-3′，TaLEA2-R1：5′-CCA-CTTTCCATCTCATCTCG-3′)，以小麦幼苗的cDNA为模板扩增，片段回收后测序.

1.3 TaLEA2的生物信息学分析

TaLEA2基因核苷酸翻译及多序列比对采用DNAMAN 5.22软件；氨基酸成分、不稳定系数、亲水系数、蛋白分子量、等电点分析采用在线软件ProtParam(http:∥web.expasy.org/protparam/)；信号肽和亚细胞定位分别采用在线软件SignalP 4.1 Server (http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)和iPSORT(http:∥ipsort.hgc.jp/)；蛋白质亲水性图谱在线构建采用在线软件ProtScale(http:∥web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl)；其他物种的氨基酸序列来源于NCBI数据库，采用MEGA 5.10软件，以邻近法构建进化树.

1.4 实时荧光定量PCR检测TaLEA2的表达

以小麦不同生长时期、不同组织以及不同胁迫处理组织的cDNA为模板，使用小麦特异性引物(TaLEA2-F：5′-GGCTACAGCATCAAGGGCAA-3′,TaLEA2-R：5′-TCCTTCTTGAGGCGAGTGGTT-3′)进行定量分析，以小麦延长因子TaEF1α作为内参基因，扩增引物为：TaEF1α-F：5′-CAGATTGGCAACGGCTACG-3′，TaEF1α-R:5′-CGGACAGCAAAACGACCAAG-3′.采用Real Master Mix(SYBR Green)试剂盒(购自天根生化科技有限公司)，在Chromo 4TM实时荧光定量PCR检测仪(BIO-RAD)上运行，数据处理采用其自带软件.

2 结果与分析

2.1 TaLEA2克隆及其编码蛋白的生物信息学分析

在小麦EST数据库中筛选并分析序列，获得与小麦抗旱相关的候选基因片段，在NCBI数据库中搜索到1条与其一致的小麦cDNA序列(ACCESSION，AK330667).采用RT-PCR技术分离得到1条1 100 bp的核苷酸序列，与候选基因序列一致，该序列包含了1个981 bp的开放阅读框，编码1个由326个氨基酸残基组成的蛋白，蛋白相对分子质量为 36 080.在NCBI氨基酸数据库中进行保守结构域分析，发现该蛋白含有2个LEA2结构域，分别位于90～186 aa和216～311 aa，表明该蛋白属于小麦LEA家族第2组(脱水素)，将其命名为TaLEA2，并且该蛋白与拟南芥第2组成员(NP_181934.1)的相似性高达64.30%.

氨基酸组成分析结果显示，该蛋白富含天冬氨酸Asp(12.6%)，异亮氨酸Ile(9.5%)，赖氨酸Lys(9.2%)，甘氨酸Gly(8.6%)和缬氨酸Val(7.4%)，而谷氨酰胺Gln(0.9%)和色氨酸Trp(0.6%)含量较低，不含半光氨酸Cys.该蛋白负电荷氨基酸总数62个，正电荷氨基酸总数43个，是一种酸性蛋白，理论等电点4.64.稳定系数(Instability index)为25.28，属于稳定蛋白.蛋白二级结构分析结果显示，TaLEA2蛋白中42%的氨基酸残基参与了β-折叠构象的形成，13.5%的氨基酸参与了α-螺旋构象的形成，α-螺旋构象主要位于该蛋白的N-端，没有明显的高级结构，推测该蛋白以无序状态存在.由于N-端没有信号肽(SP=NO，D-cutoff=0.450)，蛋白分子中也没有跨膜区，因此推测该蛋白位于细胞质中.除在80～160aa之间出现了几处弱疏水区域外，其他部分是亲水区域，采用ProtScale进行的疏水性/亲水性分析氨基酸指数为91.30，TaLEA2蛋白的平均亲水系数为-0.405，因此，该蛋白为亲水蛋白.

2.2 TaLEA2蛋白的相似性比对及聚类分析

根据TaLEA2基因编码的氨基酸序列，在大麦Hordeumvulgaresubsp.vulgare、短柄草Brachypodiumdistachyon、玉米Zeamays、水稻OryzasativaJaponica Group、高粱Sorghumbicolor、黄瓜Cucumissativus、丹参Salviamiltiorrhiza、拟南芥Arabidopsisthaliana、葡萄Vitisvinifera、大豆Glycinemax、百脉根Lotusjaponicus、苜蓿Medicagotruncatula、杏Prunusarmeniaca、烟草Nicotianatabacum及杨树Populustrichocarpa中搜索到与TaLEA2相似的第2组LEA蛋白氨基酸序列15条，发现TaLEA2的同源LEA蛋白质都含有2个LEA2结构域.氨基酸的相似性分析显示，TaLEA2与大麦中与铝离子胁迫相关的LEA2(BAJ93460.1)相似性最高(95.30%)；与拟南芥中水胁迫应答相关的LEA2(NP_181934.1)相似性最低(64.30%).同时发现搜索到的同源性蛋白均与非生物胁迫相关，如水胁迫、盐胁迫及铝离子胁迫等，推测该类蛋白与非生物胁迫相关，在进化过程中相对保守.采用MEGA 5.10软件进行聚类分析(图1)，搜索到的15条同源LEA2蛋白序列及小麦TaLEA2蛋白序列被明显的分为双子叶和单子叶2类，第Ⅰ类包括了拟南芥、烟草及大豆在内的共10条双子叶LEA2蛋白序列，第Ⅱ类包括了小麦、大麦及短柄草在内的共6条单子叶LEA2蛋白序列.聚类结果表明，LEA2蛋白分子进化与物种间的生物进化关系趋于一致.

图1 与TaLEA2相似的LEA2蛋白进化分析Fig.1 Phylogenetic analyses of LEA2 protein from plants

2.3 TaLEA2的组织特异性表达分析

在小麦苗期的根、茎及叶，成熟期的根、茎、叶及种子中，都能检测到TaLEA2的表达，表明该基因在小麦的不同发育时期的不同组织中都能表达(图2).在小麦的苗期，TaLEA2在根中的表达量最高，茎次之，叶中表达量最低；在小麦成熟时期，TaLEA2在种子中表达量最高，叶中次之，根及茎中表达量最低.综合组织特异表达结果，尽管TaLEA2在所检测的组织中均表达，但是该基因存在组织特异性表达，同时该基因的调控表达受不同发育时期的影响.

图2 TaLEA2在不同时期及组织中的表达模式

Fig.2 Expression pattern analyses ofTaLEA2 in different periods and tissues

2.4 TaLEA2在各种胁迫下的表达模式分析

在盐胁迫处理下，TaLEA2基因在根中的表达无变化，在叶片中的表达略有上升；在外源ABA处理下，TaLEA2基因在根中表达略有上升，而在叶片中略有下降，均不明显；在低温和条锈病原菌处理下，TaLEA2基因在叶片中的表达量略有上升，条锈病原菌诱导后该基因上调表达1.5倍以上，低温诱导该基因上调不明显；在干旱胁迫下，TaLEA2基因在根及叶片中均上调表达，并且明显上升，分别比对照高1.90和2.74倍.以上的结果表明，TaLEA2参与了高盐、低温、病菌及干旱等胁迫反应，推测可能与小麦生物与非生物胁迫应答过程有关，同时该基因对外源ABA处理不敏感(图3).

图3 不同胁迫下TaLEA2的表达模式

Fig.3 Expression pattern analyses ofTaLEA2 under different stress conditions

3 讨论与结论

干旱、盐碱和冻害等是限制植物生长发育的主要逆境因子，在长期的进化过程中，植物已形成了特定的抵御这些环境胁迫的复杂调控体系，如产生具有保护功能的蛋白来维持其正常的代谢活动，胚胎发育晚期丰富蛋白就是其中的一种.近些年LEA受广泛关注.大量的研究[14- 23]表明，LEA2蛋白在植物受干旱、高盐及低温等非生物胁迫过程中发挥着重要作用，但其主要的抗性机理尚不清楚.

本研究从小麦中克隆得到1条1 100 bp的核苷酸序列，编码1个由326个氨基酸残基组成的TaLEA2蛋白，蛋白相对分子质量为36 080，该蛋白含有2个LEA2结构域，并且具有LEA2家族的典型特征，富含赖氨酸Lys，不含半光氨酸Cys，脂肪族氨基酸指数为91.30，TaLEA2蛋白的平均亲水系数为-0.405，稳定系数为25.28，且无明显的高级结构，这种氨基酸组成及结构均有利于蛋白的稳定及亲水性，从而提高与水分子结合的能力，提高植物的抗旱能力.植物LEA蛋白基因的表达受多种因素影响，本研究分析了TaLEA2基因在不同组织、不同发育时期及不同胁迫下的表达模式，从分析结果可以看出该基因为组成型表达，但在不同组织及不同发育时期的表达量有所不同，该基因在成熟期的种子中高表达，推测该基因与种子脱水干燥过程有关；该基因表达受高盐、低温、病菌及干旱等胁迫的调控，尤其在干旱胁迫中该基因上调表达最明显，推测TaLEA2蛋白在小麦受到干旱失水时把足够的水分捕获到细胞内，从而保护细胞免受水分子的伤害，故TaLEA2与植物抗干旱相关.综合TaLEA2的表达数据，发现该基因除受胁迫调控外，同样受组织类型及发育过程调控.ABA调控被认为是LEA蛋白基因重要的调控因子之一，根据基因表达对ABA的依赖与否主要分为2种途径：依赖ABA的途径，如大麦的脱水素DHN1基因，以及不依赖ABA的途径[24- 25].本研究同样对小麦进行了外源ABA处理，分析结果显示TaLEA2表达不受外源ABA刺激的影响，属于不依赖ABA调控的LEA2蛋白.

综上所述，TaLEA2蛋白为组成型表达，且在逆境条件下积累，参与了小麦正常条件下的生长发育，同时也广泛参与小麦抵御逆境胁迫的响应，尤其在小麦的抗旱胁迫及种子成熟过程中发挥重要作用，但其具体功能及分子调控机制尚不清楚.下一步将通过转基因技术深入研究TaLEA2在抵御小麦胁迫(干旱)过程中的具体功能，同时也将进一步分析该基因在种子成熟过程中的表达模式，探究其在小麦种子成熟过程中的具体作用，为揭示LEA蛋白与小麦生长发育及抗旱胁迫的密切相关奠定理论基础，为小麦抗性定向分子改良提供重要的靶基因.

[1] ZHANG L，OHTA A，TAKAGI M，et al. Expression of plant group 2 and group 3 lea genes inSaccharomycescerevisiaerevealed functional divergence among LEA proteins[J]. J Biochem，2000，127(4)：611- 616.

[2] DURE L，GREENWAY S C，GALAU G A. Developmental biochemistry of cottonseed embryogenesis and germination: Changing messenger ribonucleic acid populations as shown byinvitroandinvivoprotein synthesis[J]. Biochemistry，1981，20(14)：4162- 4168.

[3] RAMANJULU S，BARTELS D. Drought- and desiccation-induced modulation of gene expression in plants[J]. Plant Cell Environ，2002，25(2)：141-151.

[4] BATTAGLIA M，OLVERA C Y，GARCIARRUBIO A，et al. The enigmatic LEA proteins and other hydrophilins[J]. Plant Physiol，2008，148(1)：6- 24.

[5] BAKER J，Van DENNSTEELE C，DURE L. Sequence and characterization of 6 LEA proteins and their genes from cotton[J]. Plant Mol Biol，1988，11(3)：277- 291.

[6] DURE L. A repeating 11-mer amino acid motif and plant desiccation[J]. Plant J，1993，3(3)：363-369.

[7] 刘洋，邢鑫，李德金. LEA蛋白的分类与功能研究进展[J]. 生物技术通报，2011(8)：36- 43.

[8] DANYLUK J，PERRON A，HOUDE M，et al. Accumulation of an acidic dehydrin in the vicinity of the plasma membrane during cold acclimation of wheat[J]. Plant Cell，1998，10(4)：623- 638.

[9] 孙歆，雷韬，袁澍，等. 脱水素研究进展[J]. 武汉植物学研究，2005，23(3)：299-304.

[10]杜俊波，席德慧，王尚英，等. 青稞脱水素基因dhn4的克隆与原核表达[J]. 四川大学学报：自然科学版，2008，45(2)：441- 445.

[11]钱刚，平军娇，张珍，等. 大麦Dhn6基因的克隆、蛋白质结构预测与干旱胁迫表达模式[J]. 遗传，2011，33(3)：270- 277.

[12]ZHANG Yuxiu，LI Jinmei，YU Fei，et al. Cloning and expression analysis of SKn-type dehydrin gene from bean in response to heavy metals[J]. Mol Biotechnol，2006，32(3)：205- 218.

[13]HARA M，TERASHIMA S，FUKAYA T，et al. Enhancement of cold tolerance and inhibition of lipid peroxidation by citrus dehydrin in transgenic tobacco[J]. Planta，2003，217(2)：290- 298.

[14]CLOSE T J. Dehydrins: A commonality in the response of plants to dehydration and low temperature[J]. Physiol Plantarum，1997，100(2)：291- 296.

[15]CAMPBELL S A，CLOSE T J. Dehydrins: Genes, proteins, and associations with phenotypic traits[J]. New Phytol，1997，137(1)：61-74.

[16]LI Rui，BRAWLEY S H，CLOSE T J. Dehydrin-like proteins in fucoid algae[J]. Plant Physiol，1997，114：479.

[17]MTWISHA L，BRANDT W，MCCREADY S，et al. HSP 12 is a LEA-like protein inSaccharomycescerevisiae[J]. Plant Mol Biol，1998，37(3)：513-521.

[18]DEAN R T，FU S L，STOCKER R，et al. Biochemistry and pathology of radical-mediated protein oxidation[J]. Biochem J，1997，324(1)：1-18.

[19]VITAMVAS P，KOSOVA K，PRAILOVA P，et al. Accumulation of WCS120 protein in wheat cultivars grown at 9 ℃ or 17 ℃ in relation to their winter survival[J]. Plant Breeding，2010，129：611- 616.

[20]WISNIEWSKI M，BALSAMO R，CLOSE T J，et al. Purification, immunolocalization, cryoprotective, and antifreeze activity of PCA60: A dehydrin from peach (Prunuspersica)[J]. Physiol Plantarum，1999，105(4)：606- 608.

[21]KOAG M C，FENTON R D，WILKENS S，et al. The binding of maize DHN1to lipid vesicles. Gain of structure and lipid specificity[J]. Plant Physiol，2003，131(1)：309-316.

[22]KOAG M C，WILKENS S，FENTON R D，et al. The K-segment of maize DHN1 mediates binding to anionic phospholipid vesicles and concomitant structural changes[J]. Plant Physiol，2009，150(3)：1503-1514.

[23]RORAT T，GRYGOROWICZ W J，IRZYKOWSKI W，et al. Expression of KS-type dehydrins is primarily regulated by factors related to organ type and leaf developmental stage during vegetative growth[J]. Planta，2004，218(5)：878- 885.

[24]ROBERTSON M，CUMING A C，CHANDLER P M. Sequence analysis and hormonal regulation of a dehydrin promoter from barley,Hordeumvulgare[J]. Physiol Plantarum，1995，94(3)：470- 478.

[25]JAGLO K R，KLEFF S，AMUNDSEN K L，et al. Components of theArabidopsisC-repeat/dehydration-responsive element binding factor cold-response pathway are conserved inBrassicanapusand other plant species[J]. Plant Physiol，2001，127(3)：910-917.

【责任编辑霍 欢】

Molecularcloning,expressionandbioinformaticanalysisofTaLEA2genefromwheat

LONG Xiangyu1, PU Zhi′en2, YANG Lijuan2, ZHENG Ke2, LIU Zehou2

(1 Rubber Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Danzhou 571737, China; 2 Wheat Institute, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China)

【Objective】 The cloning, expression and bioinformatic analysis ofTaLEA2 gene were carried out to lay the theoretical basis for salt-tolerance of wheat. 【Method】 TheTaLEA2 gene was obtained by homology cloning. Its gene structures and protein characteristics were analyzed by bioinformatic softwares. Real-time PCR was used to analyze its expression.【Result and conclusion】The results showed thatTaLEA2 contained a 981 bp ORF encoding 326 amino acids. Using bioinformatics analysis to predict and analyzeTaLEA2, the protein had classic domains and characteristics of LEA2, rich in Lys and lack of Cys, high hydrophilia (GRAVY, -0.405) and heat stability (Instability index, 25.28). The results of real-time PCR revealed that the expression ofTaLEA2 had a constitutive expression, whose levels were different in different tissues. The expression was induced markedly by drought, salt, low-temperature and pathogenic bacteria in particular, but no change in treatment with ABA. Therefore，it is speculated thatTaLEA2 can play a role not only in growth and development conditions but also in stress stage of wheat, especially in resistance to drought-stress.

wheat;TaLEA2 gene; gene clone; bioinformatic analysis; gene expression

2013- 04- 09优先出版时间2014- 07- 17

优先出版网址：http:∥www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.S.20140717.0914.033.html

龙翔宇(1983—)，男，助理研究员，博士，E-mail: xiangyulong@gmail.com

国家转基因生物新品种培育重大专项(2011ZX08002001)

龙翔宇，蒲至恩，杨丽娟，等.小麦胁迫相关基因TaLEA2的克隆、生物信息学及表达特性分析[J].华南农业大学学报，2014,35(5):88- 92.

Q349.53

A

1001- 411X(2014)05- 0088- 05