赵志华，陈可欣

天津医科大学肿瘤医院 天津 300060

乳癌组织中Pax1的表达及其对乳癌MDA-MB-231细胞生物学行为的影响

赵志华，陈可欣#

天津医科大学肿瘤医院 天津 300060

#通讯作者，女，1963年11月生，博士，主任医师，研究方向：肿瘤临床，E-mail：sunjingyan126@126.com

乳癌；配对盒家族基因1；MDA-MB-231 细胞

目的：研究Pax1在乳癌组织中的表达及其对乳癌MDA-MB-231细胞生物学行为的影响。方法采用Western blot检测200乳腺原发癌和癌旁组织中Pax1蛋白的表达。采用化学合成针对Pax1基因的两个小干扰RNA(siRNA- Pax1-1和siRNA- Pax1-2)下调该基因的表达，应用MTT和Transwell实验检测其对MDA-MB-231细胞生物学行为的影响。结果Pax1在乳腺原发癌组织中的表达低于相应的癌旁组织，沉默Pax1表达可促进乳癌细胞增殖、迁移和侵袭(F=52.413和72.741，P<0.001)。结论Pax1有望成为乳癌早期诊断和预测预后的生物分子标志物。

乳癌是女性最常罹患的恶性肿瘤[1]，其本质是一种多基因异常疾病，通过原癌基因的过表达，同时伴随抑癌基因的突变缺失，从而使肿瘤细胞逃避了正常生长的调控机制[2]。从根本上纠正与乳癌发生发展相关的基因异常的基因治疗已成为医学研究领域的热点[3]。Lai等[4]首次研究发现，配对盒家族基因1(paired boxed gene 1，Pax1)基因在宫颈癌中出现异常甲基化，甲基化异常频率可达94.5%，提示Pax1在宫颈癌的早期发现中具有重要作用。但目前对于Pax1在乳癌发生发展中的研究目前尚未见报道。作者检测Pax1蛋白在乳癌组织及相应的癌旁正常组织标本的表达情况，观察沉默Pax1基因表达对乳癌MDA-MB-231细胞生物学的影响，以期为深入研究乳癌细胞的分子病理机制提供新线索和策略。

1 材料与方法

1.1标本来源200例乳腺原发癌及其癌旁正常组织标本取自2004年9月至2010年1月天津医科大学附属肿瘤医院收治的乳癌患者，所有患者术前均未行放疗和化疗。组织样本经液氮速冻后-80 ℃保存。所有样本采集和使用均征得患者同意并签署知情同意书，并由天津医科大学附属肿瘤医院伦理委员会同意使用。

1.2Pax1蛋白的检测采用Western blot法。40 μg总蛋白经80 V电压电泳3 h后，转印至PVDF膜。TBS-T(pH 8.3)液室温封闭1 h后加入兔抗人Pax1一抗(英国Abcam公司)，4 ℃平摇过夜，TBS-T洗膜6次后加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(美国Santa Cruz公司)，室温孵育1 h，TBS-T洗膜6次， 加ECL (美国GE Healthcare 公司)，显色1～2 min。用ChemiDoc XRS凝胶成像系统(美国BIO-RAD公司)照相分析。

1.3细胞实验

1.3.1 实验分组和处理 MDA-MB-231细胞培养于含10%胎牛血清(FBS)、100 U/mL 青霉素和 100 g/L链霉素的RPMI 1640培养基(Invitrogen公司)，于37 ℃、体积分数5% CO2培养至对数生长期。接种2×105个细胞/孔于6孔板，以无抗生素的含血清培养基培养。实验为4组。空白对照组：无处理的MDA-MB-231细胞；转染对照组：转染si-control；转染1组：转染siRNA-Pax1-1；转染2组：转染siRNA-Pax1-2。si-control、siRNA-Pax1-1和siRNA-Pax1-2均由上海吉玛公司合成，转染操作严格按照试剂盒说明书进行。100 nmol/L siRNA-PAX1-1、siRNA-PAX1-2 分别与2 μL Lipofectamine 2000各溶于50 μL培养基，孵育5 min后混合20 min，缓慢滴入置于500 μL OPTI-DMEM无血清培养基的细胞中，6 h后将培养液更换为含血清的RPMI 1640培养液培养。

1.3.2 细胞增殖能力检测 采用MTT法。4组细胞分别处理48 h后，胰酶消化对数期细胞，终止后离心收集，制成细胞悬液，细胞计数调整其浓度至 1 000～10 000/孔。体积分数5% CO2，37 ℃孵育，至细胞单层铺满孔底，设3个复孔,于 24、48、72 h后每孔加入10 mL 5 g/L MTT溶液，继续培养4 h，小心用PBS冲2～3遍后。每孔加入100 μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，在酶联免疫检测仪检测570 nm处测量各孔的吸光光度(A)值。计算细胞增殖抑制率[5]。

1.3.3 细胞侵袭和迁移能力检测 采用Transwell实验。每组均将悬浮于500 μL无血清培养基的5×104个细胞分别接种于含和不含Matrigel的Transwell上室，下层加入750 μL含体积分数10%FBS的细胞培养液，培养8 h。取出Transwell小室，用棉签拭去上层未穿过的细胞，苏木素染色后封片，于镜下观察穿膜细胞数目。

1.4统计学处理采用SPSS 17.0分析。各组细胞增殖抑制率和穿膜细胞数目的比较采用单因素方差分析和LSD-t检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1乳癌组织和癌旁正常乳腺组织中Pax1的表达乳癌组织中Pax1蛋白的表达低于癌旁正常乳腺组织(图1)。

2.2 4组细胞Pax1蛋白的表达转染1组和2组中Pax1表达水平较对照组降低，见图2。

图1 2种组织中Pax1蛋白的表达

图2 转染效率鉴定

1：空白对照组；2：转染对照组；3：转染1组；4： 转染2组。

2.3沉默Pax1对乳癌细胞体外生物学行为的影响见表1。

表1 4组细胞中细胞增殖和穿膜细胞数目的比较

*:与对照组比较，P<0.05；#：与转染1组比较，P<0.05。

3 讨论

Pax1基因位于20p11.2，分布于细胞核。Pax基因家族分为4类：1类和3类在维护组织特异干细胞中发挥至关重要的作用，并发现其在多种恶性肿瘤的发展中过表达；1类和4类包括Paxl、Pax4、Pax6和Pax9，在恶性肿瘤中常表达受抑。文献[6]报道，乳癌早期组织中Pax6启动子高甲基化且低表达，Hus等[7]研究发现在肺癌组织中Pax9低表达，且Pax9高表达患者具有良好的预后。Hata等[8]发现，Pax6对胶质瘤细胞具有抑制功能，而Pax4则对人类黑色素瘤具有抑制作用，Pax基因家族在不同肿瘤中发挥着不同的作用，与肿瘤的良恶性相关，因此抑制Pax可以成为一个新的治疗靶点。研究[5]报道Pax1参与骨骼发育、转录、调控转录，是一种重要的转录因子，被认为是抑癌基因，其启动CpG岛甲基化是其在表观遗传学上的重要调节方式，与肿瘤的发生发展及转移密切相关。

该研究发现乳癌组织中Pax1蛋白的表达下降，提示Pax1在乳癌的发生发展中起重要作用。作者将针对Pax1的siRNA转染乳癌细胞系MDA-MB-231，检测到较转染非特异性siRNA的细胞Pax1蛋白表达减少，说明转染有效。 MTT检测发现低表达Pax1的乳癌MDA-MB-231细胞增殖能力明显提高；Transwell小室实验发现低表达Pax1的乳癌MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭能力明显增强。

该研究使用针对Pax1的siRNA沉默该基因表达对MDA-MB-231细胞在增殖、迁移和侵袭方面的影响，提示Paxl在乳癌的发生、发展中可能发挥潜在的抑癌基因作用，其机制有待进一步实验验证。

[1]Valentin MD, da Silva SD, Privat M, et al. Molecular insights on basal-like breast cancer[J].Breast Cancer Res Treat, 2012, 134(1):21

[2]Rakha EA,El-Sayed ME,Green AR,et al.Prognostic markers in triple-negative breast cancer[J].Cancer,2007,109(1):25

[3]Parker JS, Mullins M, Cheang MC, et al. Supervised risk predictor of breast cancer based on intrinsic subtypes[J].J Clin Oncol, 2009, 27(8) :1160

[4]Lai HC，Lin YW，Huang TH，et al．Identification of novel DNA methylation marker in cervical cancer[J].Int J Cancer，2008，123(1)：161

[5]Burgess R，Rawls A，Brown D，et al．Requirement of the paraxis gene for somite formation and musculoskeletal patterning[J].Nature,1996，384(6609):570

[6]Moelans CB，Verschuur-Maes AH，van Diest PJ．Frequent promoter hypermethylation of BRCA2，CDHl3，MSH6，PAX5，PAX6 and WTl in ductal carcinoma in situ and invasive breast cancer[J]．J Pathol，2011，225(2)：222

[7]Hsu DS，Acharya CR，Balakumaran BS，et al.Characterizing the developmental pathways TTF-1，NKX2-8，and PAX9 in lung cancer[J]．Pro Natl Acad SCI USA，2009，106(13)：5312

[8]Hata S，Hamada J，Maeda K，et al．PAX4 has the potential to function as a tumor suppressor in human melanoma[J]．Int J Oncol，2008，33(5)：1065

(2013-12-04收稿 责任编辑李沛寰)

Expression of Pax1 in breast cancer tissue and influence on proliferation and apoptosis of MDA-MB-231 cells

ZHAOZhihua,CHENKexin

CancerHospital,TianjinMedicalUniversity,Tianjin300060

breast cancer;paired boxed gene 1;MDA-MB-231 cell

Aim: To investigate the expression of paired boxed gene 1 (Pax1) gene in breast cancer tissue and to explore the influence on proliferation status, migration ability and metastatic ability of breast cancer cells MDA-MB-231．Methods: Western blot were used to examine the expression of Pax1 in samps, including 200 normal tissues and 200 primary tumors. MTT and transwell were used to analyze the ability of proliferation, migration, and invasion in Pax1 siRNA-transfected MDA-MB-231 cells. Results: The expression of Pax1 was lower in breast cancer tissues than other tissues. Furthermore, knockdown of Pax1 expression resulted in increased proliferation and invasion in MDA-MB-231 cells in vitro(F=52.413 and 72.741，P<0.001). Conclusion: The expression of Pax1 gene shows and obvious downgraded in breast cancer tissue.Low expression of Pax1 gene can increase apeptosis and proliteration of MDA-MB-231 cells, which may provide a strategy for blocking breast cancer and progression.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.04.022

R737.9