★ 王莹 杨军平 邱丽瑛 罗玉芳

(江西中医药大学附属医院 江西 南昌 330006)

应激反应理论着重阐述应激反应中神经、内分泌、免疫系统之间的相互作用和调节[1]，发生应激反应时,下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴被激活,直接作用于靶器官，导致其功能改变。已有研究表明[2,3]应激对免疫功能有不同程度的影响，应激引起自然杀伤细胞的数目和活性降低，淋巴细胞增殖能力、单核巨噬细胞吞噬能力下降,效应T淋巴细胞的功能和T淋巴细胞亚群的数目和比值发生改变，最终导致了免疫功能下降[4]。另外，应激还会引起免疫球蛋白A、免疫球蛋白G和免疫球蛋白M的改变，使机体体液免疫功能也发生改变。应激引起免疫功能改变的作用机制非常复杂，尽管这方面的研究比较多，但仍需要进一步深入探讨。

情绪应激理论与中医七情学说有不同之处，但也有共通之处，可以互相补充。情绪应激属于中医的情志异常。恐作为一种不良的精神刺激，直接损伤肾气和肾精，扰乱了脏腑功能，影响了机体正常的生理秩序。

通过观察小鼠的免疫功能的变化，探讨“恐伤肾”的免疫机理，为临床对“恐伤肾”理论的认识提供了实验依据，并通过分析金匮肾气丸对情绪应激小鼠的补肾行气的调节作用，探讨其作用机制，对临床的诊断和治疗具有重要的理论依据，为进一步研究含药血清的作用打下坚实的基础。

1 试验材料

1.1 实验动物 昆明种小鼠108只，由南昌大学动物中心提供，雌性，体重20±2g，室温(24±1)℃、湿度55±5%的环境，自然昼夜节律光照，适应环境一周。在此期间，动物均可自由摄食和饮水。观察一周后开始实验。

1.2 仪器和试剂 仪器为西班牙biosystem A15特定蛋白分析仪；IgA(免疫球蛋白A)、IgG(免疫球蛋白G)、IgM(免疫球蛋白M)检测试剂由西班牙Bionsystems S.A.公司生产，批号02159。

2 方法

2.1 造模 选用一种较独特的应激方法(猫吓鼠结合空瓶实验)[4-6]，在固定的时间给小鼠喂水,让小鼠养成习惯，一周后在相同的时间给予空瓶刺激，引起小鼠情绪应激反应。自制应激箱装置：猫笼放置成年且凶狠的家猫一只，并置于鼠笼上，猫探爪可略触及小鼠，应激小鼠2小时，中途喂食小鼠一只，予以强化应激。

2.2 动物分组 动物随机分为9组，按给药和应激时间分为7、14、21天组，动物称重后，按组放置不同的实验间，分组喂养。

2.3 给药 干预组从应激开始给药，金匮肾气丸成人用量为12g/日，按中剂量计算为400mg/100g动物，每天给药1次，给药量为0.4mL,浓度为0.2g/mL。

2.4 动物处理 实验完成后，各组动物称重后取血，血液于室温放置2小时，以2500r/min离心20分钟，吸出血清，放入-80℃冰箱保存备用。在冰面上迅速地取出胸腺、脾脏，滤纸吸干血后，称取各脏器重量，计算脏器指数。脏器指数计算：脏器指数=脏器重量/动物体重(mg/g)。

2.5 免疫球蛋白测定 免疫球蛋白的检测采用散射比浊法，测试试剂盒为西班牙Bionsystems S.A.公司生产的专用试剂盒。

3 结果

3.1 应激对小鼠行为的影响 对照组小鼠状态佳，运动活泼，毛发洁白柔软，摄食饮水均正常。应激组小鼠随应激时间的延长，性情变的烦躁、易怒，情绪不稳定，攻击性强，灌胃不易配合。而且容易受惊吓,呼吸急促、神情紧张，常处于警戒状态。部分小鼠毛色泛黄，成小缕状,也出现拱背竖毛及掉毛现象。排尿增多，可能与其肾功能损伤有关。给予金匮肾气丸干预后，应激小鼠紧张程度有所减轻，呼吸急促有所改善，基本无毛色带黄情况出现，毛发大致均匀，少有掉毛现象，实验后期体能状况亦较前改善，尿量亦有所减少。

3.2 应激不同时间对小鼠胸腺的影响及中药调节 见表1。

表1 应激不同时间对小鼠胸腺重量、胸腺指数的影响及中药调节 ±s)

表2 应激不同时间对小鼠脾脏重量、脾脏指数的影响及中药调节 ±s)

3.3 应激不同时间对小鼠脾脏的影响及中药调节 见表2。

3.4 应激不同时间对小鼠血清免疫功能的变化及中药调节 见表3。

表3 应激不同时间对小鼠血清免疫功能的变化及中药调节 ±s)

4 讨论

表1、2结果显示：应激组小鼠的胸腺、脾脏重量与指数均低于正常对照组(P<0.05)，有统计学意义。应激引起下丘脑-垂体-肾上腺-靶器官调节紊乱,影响着机体的免疫功能，表明应激导致了小鼠免疫器官的退化，表现为胸腺、脾脏萎缩[7,8]，随着应激时间增加，胸腺、脾脏萎缩更为严重。胸腺萎缩，影响细胞免疫功能，对体液免疫功能也有间接的影响。金匮肾气丸可否拮抗胸腺的萎缩，从而延缓衰老过程，将是一个十分有意义的课题。金匮肾气丸干预组小鼠胸腺、脾脏重量及指数与应激组相比升高，有显著性差异(P<0.05)；其原因可能是应激引起了免疫器官的退化，而金匮肾气丸干预其退化过程，从而起到对免疫器官的保护作用。

表3结果显示：应激组小鼠IgA含量升高、IgG和IgM含量降低,与对照组相比有显著性差异(P<0.01)，是因为神经、内分泌、免疫系统这三大系统彼此之间相互平衡协调，使机体在生理或病理状态下维持相对稳定和平衡的状态，并调控着机体的各项生命活动，这不仅体现在系统器官等方面的功能调控，还体现在分子水平的调控。应激组小鼠的IgG和IgM含量下降，引起其下降的原因可能为：(1)胸腺萎缩，分泌胸腺肽，产生T淋巴细胞减少，单核巨噬细胞的吞噬活性降低，机体免疫功能下降，免疫球蛋白水平下降；(2)脾脏萎缩，组织中含有的淋巴细胞和巨噬细胞减少，使机体体液免疫受到抑制，机体发生免疫应答和产生抗体的过程受到影响,从而引起免疫球蛋白水平降低；(3)体液免疫通过神经递质、细胞因子等多种物质参与，造成小鼠的免疫功能抑制，免疫球蛋白水平降低。干预组小鼠IgA的水平降低、IgG和IgM含量升高，说明金匮肾气丸对“恐伤肾”应激小鼠的免疫球蛋白变化、免疫抑制有着较为理想的干预调节作用。

[1]孙琪,敖海清,郭维.逍遥散抗慢性应激损伤研究进展[J].新中医，2011,43(11)：105-107.

[2]Van-Dijken HH, Mos J, VanderHeyden JA, et al.Character-ization of stress-induced long-term behavioral changes in rats: evidence in favor of anxiety[J].Physiol Behav, 1992,52(5): 945-995.

[3]Uchakin PN, Tobin B, Cubbag M.Immune responsiveness following academic stress in first-year medical students[J].Interferon Cytokine Res.2001,21(9): 687-694.

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[5]梁斌,黎静,杨晓梅,等.空瓶刺激心理应激法建立大鼠血管内皮损伤模型的评价[J].山东医药,2013,(20):11-14.

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[7]Platzer C,DokeWD,VolkHD, et al .Catecholamines trigger IL-10 release in acute systemic stress reaction by direct stimulation of its promoter/en-hancer in monocytic cells[J].Neuroimmun,2000,105:31.

[8]Pujol,J.F.Increased Turnover of Cerebal Norepine during Rebound of Paradoxical Sleep in the Rat[J].Sience,1968,159:112-124.