代叶红 李荣亨 龙再现

·论著·

复元胶囊对兔膝骨关节炎MMP-3、IL-1及SOD含量的影响

代叶红 李荣亨 龙再现

目的观察复元胶囊对兔膝骨关节炎(KOA)软骨组织变化及血清中超氧化物歧化酶(SOD)活性、白细胞介素-1(IL-1)、基质金属蛋白酶3(MMP-3)含量的影响。方法新西兰兔32 只，随机分为复元胶囊组、壮骨关节丸组、模型组和正常组，除正常组外，其余各组均按照Hulth法造模建立膝KOA动物模型，复元胶囊组、壮骨关节丸组分别给予复元胶囊组、壮骨关节丸灌胃，正常组及模型组给予0.9%氯化钠溶液。灌胃4周后分别随机选取6只采取血清检测SOD活性及MMP-3、白细胞介素-1(IL-1)的含量，采用HE染色光镜观察软骨组织病理改变。结果复元胶囊组软骨细胞明显增加，微血管管壁基本恢复正常，复元胶囊组血清中MMP-3、IL-1含量低于其他组(P<0.05)； SOD含量高于其他组(P<0.05)。结论使用复元胶囊可显著降低兔膝关节局部MMP-3、白细胞介素-1(IL-1)的含量，提高SOD的活性，从而有利于抑制滑膜炎症，缓解 KOA 早期的疼痛、肿胀症状，延缓关节软骨的退变。

复元胶囊; 骨关节炎；血清超氧化物歧化酶活性；白细胞介素-1、基质金属蛋白酶3

骨关节病好发于老年人，60岁以上人群患病率高达50%以上，75岁以上人群则达80%，随着我国老龄化不断加剧，膝骨性关节炎(KOA)引起生活质量下降，是严重危害中老年人的主要疾病。我们在长期的临床实践中总结出KOA的基本病机是肝肾不足、血瘀阻络，并在此基础上运用补益肝肾、强筋壮骨、化瘀通络的治法，拟方复元胶囊，通过建立兔KOA模型，灌胃4周后观察兔膝关节滑液中细胞因子MMP-3、白细胞介素-1(IL-1)及SOD含量的影响，以及关节软骨组织变化，发现复元胶囊能缓解膝关节疼痛、改善功能有很好的疗效，探索中药复方治疗KOA的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物与分组 健康新西兰大白兔32只，体重(2.5± 0.1)kg，购自重庆医科大学动物中心，动物合格证号：SCICK(渝) 2007-0001。随机分为4组：复元胶囊组、壮骨关节丸组、模型组和正常组，每组8只，给药4周。

1.2 实验药品及试剂 MMP-3、IL-1、SOD试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供。复元胶囊由淫羊藿、鹿茸、黄芪、生晒参、续断、丹参、川芎、枸杞子等组成，由重庆希尔安药业股份有限公司加工生产， 壮骨关节丸由深圳华润三九医药股份有限公司生产。

1.3 造模方法 采用改良 hulth 法构建兔膝骨关节炎模型，速眠新Ⅱ0.2 ml/kg肌注麻醉后，选右后肢外侧，髌腱旁纵形切口，长约6 cm，切开关节囊，向内侧推开髌骨，充分显露兔膝关节，剪断前后交叉韧带并切除外侧半月板，避免损伤关节面软骨，0.9%氯化钠溶液冲洗关节腔，逐层缝合切口，无菌包扎固定。术后所有动物每天驱赶60 min。

1.4 给药方法 造模后 1周开始给药，复元胶囊组每只每次灌胃剂量为 0.727 g·kg-1·d-1，每天灌胃3次，壮骨关节丸组每只每次一丸、每天灌胃3次，模型组每天灌予10 ml 0.9%氯化钠溶液，正常组不给予任何药物。每组均连续灌胃4周后处死动物。

1.5 观察指标 分别与造模前、造模后，治疗中、治疗完毕后将实验动物处死，心腔内取血5 ml，4℃静置过夜,3 000 r/min离心 20 min,取上清液，经0.22 μm抽滤除菌后分装,-20℃保存备用。用氧化还原酶法测定SOD含量，用放免法测定MMP-3，用硝酸还原酶法测定IL-1含量。

2 结果

2.1 直视观察 直视下见关节承重区的软骨变软、碎裂、软骨全层破坏、大部分软骨下骨质裸露、骨面下骨牙质变。

2.2 光镜下观察 正常组软骨细胞无异常(图1)。将实验兔造模后和冶疗后的关节软骨进行病理学分析。造模后病理：可见软骨细胞明显减少，骨面下骨髓腔内血管和纤维组织增生(图2)。冶疗4周后，壮骨关节丸组末有明显变化(图3)，复元胶囊组软骨细胞明显增加，微血管管壁基本恢复正常(图4)。

图1 正常组可见软骨细胞无异常(HE×400)

图2 模型组可见软骨面下骨髓腔内血管和纤维组织增生(HE×400)

图3 壮骨关节丸组：软骨骨面下骨髓腔内微血管管壁增厚、变形(HE×400)

图4 复元胶囊组：软骨细胞明显增加、微血壁基本恢复正常(HE×400)

2.3 治疗4周后血清中MMP-3、IL-1、SOD含量 SOD含量：复元胶囊组SOD含量明显升高，与壮骨关节丸组、模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)，与正常组比较差异无统计学意义(P>0.05)；MMP-3、IL-1含量：复元胶囊组MMP-3、IL-1含量明显降低，与壮骨关节丸组、模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)，与正常组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 治疗4周后血清中MMP-3、IL-1、SOD含量

表1 治疗4周后血清中MMP-3、IL-1、SOD含量

组别SOD(μmol/L)IL-1(μmol/L)MMP-3(μg/L)正常组392±16112±14136±37模型组221±23* 341±17*259±17*壮骨关节丸组251±24* 264±15*201±18*复元胶囊组378±32139±35142±13

注：与复元胶囊组比较，*P<0.05

3 讨论

KOA是由于关节软骨破坏、变性、骨质增生为特征的慢性关节病，临床上以膝关节肿痛、骨质增生及活动受限最为常见[1]。KOA发病的主要原因有生物力学损伤、机械性损伤、遗传因素等，其中主要是机械性损伤。关节软骨细胞的代谢大多数为无氧代谢途径[2，3]，软骨基质在特定酶的作用下导致降解，其中外源性酶，如基质金属蛋白酶-3，可能生成于关节滑膜，然后被分泌到来自A型和B型滑膜内衬细胞的溶酶体的滑膜液中，在病理情况下，当多形核粒细胞和巨噬细胞进入关节腔时，它们分泌出胶原酶、溶解酶或中性蛋白酶，导致软骨降解，致使滑膜、软骨和骨的代谢改变，产生炎症、关节结构破坏。另外细胞因子如白细胞介素-1(IL-1)，能刺激基质金属蛋白酶-3的前体，最终导致软骨基质的降解；也可通过刺激关节滑膜细胞增殖和变性，促进滑膜细胞金属蛋白酶分泌，抑制或干扰软骨细胞表达。伍捷进研究表明KOA患者血清及关节液中MMP-3含量与IL-1)成正相关[4]。超氧化物歧化酶(SOD)是一种新型酶制剂，能提高机体抗氧自由基系统的能力，甚至消除关节和血清中过多的氧自由基IL-1和IL-1，保护软骨细胞进一步受损伤，延缓软骨退变，促进软骨修复作用，与李喜辉等[5]的实验研究证实一致。

祖国医学认为膝骨关节炎属痹证、骨痹范畴，《内经》云:“肾主骨、肝主筋，膝为筋之府”。易君山认为主要是肝肾不足、瘀血阻滞[6]，治疗上张文柱[7]以温热之剂熏洗使之；杜见斌[8]认为应以益肝补肾通络为法。我们选用复元胶囊，以补益肝肾、强筋壮骨、化瘀通络为主，通过实验证明复元胶囊能够降低KOA关节液中MMP-3及IL-1的含量，提高SOD的浓度，具有保护关节软骨、延缓软骨退变，缓解关节疼痛，为临床治疗提供理论依据。

1 邓廉夫，柴本甫.IL-21，TNF和IL-26与骨关节炎.国外医学创伤与外科基本问题分册，1996，5：102-106.

2 Gylys-Morin VM,Hajek PC,Sarrtoris DJ,et al.Articular cartilsge defects:Detectability in cadaver knees with MR.AJR Am J Roentgenol，148：1153-1157.

3 Wolff SD,Chesnick S,Frank JA,et al.Magnetization transfer contrast：MR imaging of the knee.Radiology，1991：179，623-628.

4 伍捷进，吴启富.健骨颗粒冲剂对膝骨关节炎大鼠血清和关节液中肿瘤坏死因子-α及基质金属蛋白酶-3的影响.中医正骨，2012，24：20-22.

5 李喜辉，白书臣，樊晨晖，等.骨痛膜对兔膝关节骨性关节炎血清中SOD、NO、HA含量影响的实验研究.现代中西医结合杂志，2009，18：3931-3932，3981.

6 易君山，陈平艳.自拟健骨蠲痹汤治疗膝骨性关节炎163例.中国民族民间医药，2008，17：60-61.

7 张文柱.增生性膝关节炎临床治疗观察.天津中医，1993，17：27.

8 杜见斌.益肝补肾通络法治疗骨性关节炎96例.山东中医杂志，1992,11：23.

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.08.015

400016 重庆市，重庆医科大学附属第一医院中西医结合科(代叶红、李荣亨)；重庆市秀山县人民医院骨科(龙再现)

R 684.3

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1002-7386(2014)08-1161-02

2013-11-12)