陆明海，姚玉昌，刘玉峰，王素梅，何海娟，李 武

(1.黑龙江农垦科技职业学院，哈尔滨 150431；2.东北农业大学，哈尔滨 150030；3.黑龙江省农业科学院，哈尔滨 150086；4.黑龙江职业学院，哈尔滨 150080)

随着动物基因工程、细胞工程、胚胎工程等高新生物技术日新月异的发展，转基因动物生物反应器的制备、哺乳动物体细胞克隆、基因打靶、基因敲除等高新生物技术已开始从实验室走向广阔的应用市场[1]。尽管上述高新生物技术的应用前景十分诱人，但是其主要应用基础技术之一的超数排卵技术的实际应用效果，仍远未达到人们的预期。影响超数排卵效果的因素非常复杂，迄今其获卵效果还不是十分稳定。

笔者在最近两年进行的四次转基因试验，都是利用原核注射法生产转基因山羊，这种方法生产转基因动物是比较有效的的技术手段，但在这个过程中需要大量的原核胚胎，而超数排卵技术是供应大量成熟优良的原核胚的重要技术手段。本文以这四次生产转基因山羊为契机，对可能影响转基因山羊超数排卵的左右卵巢、体重、FSH剂量、超排季节等因素进行系统观察、统计和分析，以期提高山羊超数排卵生产原核胚的生产效率，从而提高转基因山羊的生产效率，为今后生产转基因山羊奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验药品及设备

促卵泡素(FSH)100 IU/只，促黄体素(LH)200 IU/只，孕马血清促性腺激素(PMSG)1 000 IU/只，宁波激素厂产；氯前列烯醇2 mL/只，上海计划生育所产；分叉阴道栓(CIDR)20个/包，冲胚液(PBS)1 000 mL/袋，Holding试剂50 mL/袋，新西兰产；海绵栓(50个/包)，黑龙江省农科院畜牧所产。

其它实验药品有酒精、碘酒、新洁尔灭、抗生素、生理盐水、青霉素、链霉素。

实验用设备及器械主要有：腹腔镜、腹腔内输精枪、冲卵管、细菌滤器、捡胚针、移胚针、实体显微镜、恒温台、水浴锅等。

1.2 胚胎的获取

1.2.1 试验动物选择

选择膘情好，无明显繁殖疾病，具有正常发情周期的山羊作为供体，当地土种山羊母羊作为受体。

1.2.2 供体山羊超排处理

分别在2010年的5月、7月、12月、2011年12月进行了4次超数排卵转基因实验。每次实验，分别以受供体同时埋栓当天记第0天，在埋栓第14天时，在早晨6：00开始给供体羊进行超数排卵处理，每天早晚各一针，采用促卵泡素(FSH)递减法进行，连续8针；在埋栓的第16天晚或第17天早对受体进行撤栓，同时肌注200～250 IU 孕马血清促性腺激素(PMSG)；供体在埋栓的第17天时进行撤栓，同时肌注前列腺素(PG)0.1 mg；在最后一针FSH注射完的下一个晚上进行肌注促黄体素(LH)100 IU；于注射LH的当天下午进行腹腔内输精。在输精后的第2天早8时进行手术冲胚。

1.2.3 冲胚方法

采用常规手术方法冲胚，以输精时腹腔镜的入口为基础，以一食指的粗细为准，拉出子宫角进行冲胚，一侧结束还纳后，再拉出另一侧进行冲胚。采用逆向冲胚法，从输卵管伞部回收早期胚胎，在实体显微镜下将胚胎捡出，进行转基因胚胎构建。

1.3 实验地点

青岛森淼生物技术有限公司实验基地。

1.4 数据分析

采用excel中的数据分析软件计算进行差异显著性分析，以p值0.05和0.01作为显著性检验的标准，结果均以平均值±标准误差表示。

2 结果与讨论

2.1 山羊超数排卵实验情况

本研究对近几年所做的山羊超数排卵生产原核胚效果的影响进行了统计分析。详见表1。

表1 山羊超数排卵情况

表1为在2010～2011年进行的4次超数排卵的试验效果，总体平均获卵数为12.8枚/只。

2.2 左右卵巢排卵差异情况

对近几年所做的山羊超数排卵过程中左右卵巢排卵情况进行了统计分析，其效果如表2所示：

表2 山羊超数排卵中左右卵巢排卵数比较

注：P>0.05，两者差异不显著。

本实验对于116只个体进行左右卵巢排卵数的比较。统计结果表明，山羊左右两侧在排卵数上没有差异，两卵巢排卵数是相同的。所以，在冲胚时两侧冲胚要同样重视。

2.3 FSH剂量对山羊超数排卵的影响

对近几年所做的山羊超数排卵过程中，不同FSH剂量对超数排卵效果的影响进行了统计分析。见表3。

表3 不同剂量FSH超数排卵情况比较

注：P>0.05，平均获卵数各组间差异不显著。

本实验对不同剂量的超排效果进行了比较(如表3)。研究表明：在试验羊随机区组设计上，各组平均获卵数和平均可用胚数差异不显著。表明180～240 IU的FSH对山羊超排效果没有显著差异。黄俊成等报道[2]，同一批号的FSH剂量在其一定的剂量范围内变化时，对本地山羊和奶山羊的超数排卵效果影响不显著。本研究结果与其相似。这表明，注射外源FSH可促进卵巢中卵泡的发育、成熟，但到达一定剂量后，超数排卵效果并不随着外源FSH量的增加而增加。一般来说，药物用量少可以降低成本，所以在今后超排方案设计中，可以适当降低山羊的超排用药量。

2.4 山羊体重对超数排卵效果的影响

对近几年所做的山羊超数排卵过程中，供体体重对超数排卵效果的影响进行了统计分析，其效果如表4所示：

表4 山羊体重对超排效果的影响

注：P>0.05，各组间平均获卵数差异不显著。

本研究对于体重在25～45 kg的山羊进行超排处理，以5 kg为一个梯度进行研究。研究表明：各组之间在平均获卵数上差异不显著。结果表明，山羊在25～45 kg体重之间进行超数排卵处理效果上没有差异，都可以取得比较一致的结果。李太坤等报道[3]，30～50 kg山羊超排对超排结果没有显著影响。本文与之有类似的结果。所以在选择山羊供体上，只要健康无病，体况良好，对于体重在一定范围内，可以不必过分苛求。有研究表明[3～5]，供体在激素剂量、纯度等一定的条件下，体重稍小的山羊卵巢发育排卵的卵泡及未排卵的卵泡显著较多，且在一定的体重范围内与体重呈正相关。本研究的结果也可见相同的趋势。

表5 单位体重FSH剂量获卵数比较

注：P>0.05，平均获卵数，各组间差异不显著。

对于不同FSH剂量与山羊的体重进行比值，取比值范围5.5～7.0，以0.5为梯度进行研究。研究表明：各组之间在平均获卵数上差异不显著。这个指数是将超排山羊体重和超排剂量相结合，能更好地对这两个指标进行衡量，对未来设计超排方案的剂量确定有很好的借鉴意义。在不影响结果的前提下，可以减少用FSH的量，节约超数排卵成本。

2.5 不同季节超排对排卵数的影响

对近几年所做的山羊超数排卵过程中，超排季节对超数排卵效果的影响进行了统计分析。见表6。

表6 季节对山羊超排的影响

注：P>0.05，差异不显著。

本研究对于超数排卵进行的季节进行了统计。结果表明：山羊在春季和冬季进行的超数排卵操作时，两季节平均获卵数上差异不显著。山羊是常年发情动物，在各个季节都会发情。2001年苏和等报道[6]，6月和12月份超排效果不好，与本研究不同。

3 结论

3.1 山羊在超数排卵时，左右卵巢排卵数差异不显著。

3.2 山羊体重在25～50 kg之间对超排结果没有差异。

3.3 山羊超排剂量与体重之比(IU/kg)在5.5～7.0之间效果差异不显著，可以取得比较好的超排效果。

3.4 山羊在春季和冬季的超排效果没有差异。

[1] 倪和民，张鸿波，刘云海，等.3个品种绵羊超数排卵处理后卵巢上促黄体素受体表达差异的研究[J].畜牧兽医学报，2011，42(11)：1625-1631.

[2] 黄俊成，史洪才，杨梅，等.山羊的超排处理及影响因素的研究[J].草食家畜.2001年(增刊)：107-109.

[3] 李太坤，李文婷，邹恒，等.山羊体重、重复超排次数对超数排卵效果的影响[J].上海畜牧兽医通讯，2011，6：31-32.

[4] 张琐林，王述宇.波尔山羊超数排卵方案的研究[J].中国草食动物，2001，4：10-14.

[5] Picazo R A，Cocero M L，Barragan，et al.Effects of LH administration at the end of an FSH superovulatory regimen on ovulation rate and embryo production in three breeds of sheep[J].Theriogenology，1996，41(1)：1065-1073.

[6] 苏和，赵霞，达来.波尔山羊超数排卵技术的研究[J].内蒙古畜牧科学，2001，22，(3)：36-37.