洪雅真， 林晓凤， 李继秋

(华南师范大学生命科学学院，广东省水产健康安全养殖重点实验室，广东省高等学校生态与环境科学重点实验室，广州 510631)

谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，简称GPx)是一种重要的抗氧化酶，广泛存在于有机体内，通过还原氢过氧化物来减少机体所受到的氧化损伤[1]．谷胱甘肽过氧化物酶作为生物标记物在生态毒理学得到广泛的应用[2-4]，其cDNA特征分析是深入开展其功能研究的前提和基础．随着环境风险评估需要和监测技术的发展，分子生物学技术在生态毒理学研究中得到广泛应用[3-7]．

原生动物是动物界中最低等的一类真核单细胞动物，具有个体微小，分布广泛，生命周期短，繁殖快，对环境变化反应敏感的特征[8]，是国际公认的环境监测指示生物．其中，纤毛虫原生动物扇形游仆虫(Euplotesvannus)作为模式生物被成功地应用到生态毒理学研究中[9-10]，但有关其谷胱甘肽过氧化物酶的分子信息缺乏．本研究旨在克隆扇形游仆虫GPx的cDNA全长序列，探讨扇形游仆虫GPx的核苷酸和氨基酸序列特征、相关蛋白信息及其与其他种属的亲缘关系，研究结果将为进一步探讨纤毛虫的功能基因提供基础信息．

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 受试生物 扇形游仆虫由中国海洋大学原生动物学研究室提供，于华南师范大学原生动物学研究室种库16 ℃保存(编号：051201)，以大米粒富集细菌培养保种．

1.1.2 主要试剂 DH5α大肠杆菌(Escherichiacoli)感受态细胞购自广州东盛生物科技有限公司．总RNA极速抽提试剂盒购自上海飞捷生物技术有限公司． pMD18-T vector、 RNase Inhibitor、 Ex Taq DNA聚合酶、 M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit、 SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit、 DNA Marker、 RNase-free H2O 购自宝生物工程(大连)有限公司．RQ1 RNase-Free DNase购自Promega公司，琼脂糖DNA纯化回收试剂盒购自天根生化科技有限公司．

1.2 基因克隆

1.2.1 cDNA合成 从溶菌酶处理过的E.vannus提取总RNA，经DNase消化，反转录合成的cDNA为供试材料．

RACE cDNA模板制备：3′-RACE、5′-RACE cDNA模板的制备参照Clontech的SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit说明操作．

5′-RACE cDNA通过改进的lock-docking oligo(dT)引物(5′-RACE CDS Primer A)和SMARTer ⅡA oligo合成．5′-RACE CDS Primer A含有2个兼并核苷酸位于3′末端，使得引物位于poly A尾的起始位置，可消除传统oligo(dT)引物3′端的异质性[11]．3′-RACE cDNA通过特殊的oligo(dT)引物(3′-RACE CDS Primer A)，经传统的反转录程序合成．3′-RACE CDS Primer A包含5′- CDS Primer具有的lock-docking核苷酸序列，且在5′端含有SMARTer序列的一部分．将SMARTer序列导入5′、3′-RACE cDNA，可识别SMARTer序列的Universal Primer A Mix(UPM)和不同的基因特异性引物分别进行RACE PCR扩增．

1.2.2GPx基因兼并引物设计 利用NCBI 搜索不同物种中谷胱甘肽过氧化物酶的氨基酸序列．将搜索到的谷胱甘肽过氧化物酶基因的不同氨基酸序列在Clustal W 上进行同源性比对，依据保守区域的氨基酸序列利用Primer Premier5.0 设计兼并性引物(表1)(由上海生工生物技术服务有限公司合成)．

1.2.3GPxcDNA的克隆与测序 以E.vannus的cDNA为模板，利用设计的兼并引物扩增GPx基因片段．依照琼脂糖DNA纯化回收试剂盒说明，对目的产物进行切胶回收．参考pMD18-T Vector连接试剂盒中的说明书将目的基因连接到pMD18-T载体上，转入E.coliDH5α感受态细胞中．通过含氨苄青霉素的LB平板进行抗氨苄筛选，挑取阳性菌落(含重组质粒)进行菌落PCR检测，同时进行LB液体培养基摇菌．选取经PCR检测，且产物条带大小正确的菌液，送深圳华大基因科技有限公司测序鉴定．

利用NCBI BLAST分析工具检测测序结果为所需的目的基因，再设计GPx基因特异性引物(GPx 3′-RACE1，GPx 3′-RACE2)、 (GPx 5′-RACE1，GPx 5′-RACE2)(表1)进行PCR 扩增获得GPx全长基因．

表1 GPx基因扩增引物序列Table 1 Primers used in GPx cloning

RACE PCR反应条件：94 ℃预变性5 min，1个循环；94 ℃ 45 s，70 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，1个循环；随后每个循环退火温度下降1 ℃，直到退火温度降至58 ℃；然后94 ℃ 45 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 10 min，4 ℃保存．

巢式PCR：利用RACE试剂盒引物NUP、GPx 3′-RACE2和GPx 5′-RACE2进行巢式PCR，反应体系和条件同上．

PCR 产物的回收、连接、转化以及测序同前．

测序结果在NCBI上进行比对分析，确定目的片段．将3′-RACE 和5′-RACE测序结果与前面目的基因片段拼接，将拼接好的序列用NCBI 网站上的protein blast 和blastx工具在GenBank数据库中进行相似性和同源性查找，利用BioEdit软件进行同源性比对．全长序列的开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)序列用DNAstar软件进行分析．

1.3 氨基酸序列特征

用DNAstar的EditSeq程序对获得的GPx核苷酸全长序列进行翻译，获得氨基酸序列后，在NCBI protein blast上进行检测．对该蛋白质的等电点和相对分子量利用在线程序Compute pI /Mw tool进行评估[12]，应用SignalP 4.1、NetNGlyc 1.0和TMHMM 2.0在线分析软件预测该蛋白的信号肽和潜在的N-糖基化位点，判断其是否属于分泌蛋白以及形成跨膜结构域等．

1.4 ML进化树的构建

从GenBank数据库中下载到21条GPx蛋白序列，其中4条来自纤毛虫序列．利用BioEdit软件进行序列比对，并用Phyml软件构建GPx的最大似然树．

2 结果与分析

2.1 扇形游仆虫GPx基因的克隆

以反转录的cDNA为模板，用兼并引物GPx1、GPx2克隆GPx基因片段．PCR产物(图1A)经纯化回收、连接、转化及测序得到GPx基因片段的序列，并在NCBI的blastx上进行比对．比对结果发现该序列与厚体游仆虫Moneuplotescrassus、嗜热四膜虫Tetrahymenathermophila的谷胱甘肽过氧化物酶相似度最高，达到49%以上．

根据该基因片段的序列设计3′、5′ 端特异性引物，通过3′-RACE得到一条383 bp的cDNA片段(图1B)，其中包含TAG和polyA尾．同时进行5′-RACE，测序得到一条314 bp的cDNA片段(图1B)．将5′-RACE和3′-RACE克隆结果进行拼接，得到一条长为672 bp的谷胱甘肽过氧化物酶cDNA序列(图2)，GenBank登录号为KF049698．在NCBI的blastx上进行比对，该序列与其他纤毛虫的GPx基因家族同源性较高，如与厚体游仆虫Moneuplotescrassus、嗜热四膜虫Tetrahymenathermophila及三棱尖毛虫Oxytrichatrifallax的GPx的序列相似性分别为65%、49%和45%．因此，可以判断扩增得到的cDNA片段是扇形游仆虫谷胱甘肽过氧化物酶蛋白家族基因．

(A)中M为DNA相对分子质量标准(DL2000)，1为PCR得到的E.vannusGPx基因片段；(B)中M为DNA 相对分子质量标准(DL2000)，1为3′-RACE PCR扩增产物，2为5′-RACE PCR扩增产物．

图1E.vannusGPx基因PCR扩增产物电泳图

Figure 1 PCR amplification ofE.vannusGPxgene

起始密码子ATG与终止密码子TAG均用斜体阴影表示；3个催化残基用方框标记；3个特征性基序用下划线标记；其中，48NVASKCGLT56(加粗斜体) 是GPx 的催化活性区，77IFAFPCNQF85(斜体)是GPX 的标志性基序．

图2E.vannusGPx的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列

Figure 2 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence ofE.vannusGPxcDNA

2.2 扇形游仆虫GPx基因的核苷酸、氨基酸序列特征

核苷酸全序列和推导出的氨基酸序列结果表明，该cDNA序列包含一个549 bp的开放阅读框(ORF)，编码182个氨基酸；5′UTR为25 bp，3′UTR为98 bp，其中包括一个终止密码子(TAG)和Poly A尾(图2)．该GPx蛋白理论等电点(pI)为4.40，相对分子量约为20.34×103，属于硫氧还蛋白超家族，且具有一定的保守性，含有3个催化残基和6个二聚体界面(图3)．48NVASKCGLT56、77IFAFPCNQF85和147WNFAKFL1533个结构域是GPx 的特征性基序，48NVASKCGLT56是GPx 的催化活性区，77IFAFPCNQF85是GPx 的标志性基序．SignalP 4.1、NetNGlyc 1.0和TMHMM 2.0在线软件分析结果表明，该基因编码的多肽链无信号肽和潜在的N-糖基化位点，不属于分泌蛋白，未形成跨膜结构域．纤毛虫为单细胞生物，因此该蛋白为胞内酶．

同源性分析发现(图4)，E.vannusGPx编码的氨基酸序列与其他纤毛虫的GPx氨基酸序列具有较高的同源性，同源性比较显示，E.vannusGPx氨基酸序列与其他纤毛虫GPx有较高的同源性，与厚体游仆虫Moneuplotescrassus、嗜热四膜虫Tetrahymenathermophila、第四双小核草履虫Parameciumtetraurelia及三棱尖毛虫Oxytrichatrifallax的GPx氨基酸同源性分别为65%、49%、45%和45%，在3个特征性结构域高度保守，3个保守氨基酸Cys53、Gln84和Trp147构成催化三联体，为CysGPx．根据相近物种的GPx氨基酸序列构建的最大似然树显示，E.vannus的GPx与厚体游仆虫Moneuplotescrassus聚为一支(图5)，且与其他纤毛虫物种同源性较高，亲缘性较近．

图3 BlastP预测推断的氨基酸序列特征

黑线表示高度保守的特征性结构域，其中构成催化三联体的3个氨基酸Cys53、Gln84、Trp147用倒三角形标注．E.vannus：扇形游仆虫；M.crassus：厚体游仆虫；P.tetraurelia：第四双小核草履虫；T.thermophila：嗜热四膜虫；O.trifallax：三棱尖毛虫；C.reinhardtii：莱茵衣藻；T.cruzi：克氏锥虫；L.braziliensis：巴西利什曼原虫

图4E.vannusGPX编码的氨基酸序列与其他单细胞生物GPx氨基酸同源性分析

Figure 4 Amino acid alignment ofE.vannusGPX with other single cell species GPx

图5 根据不同物种的GPx氨基酸序列构建的最大似然树

3 讨论

在动物GPx酶分子中，催化残基C/U、Q和W分别位于3个保守结构域中，这3个结构域在E.vannusGPx中也高度保守．与其他高等动物GPx活性中心的重要构成成分不同的是：E.vannusGPx中由Cys(UGU编码)替代了SeCys(UGA 编码)，说明E.vannusGPx是非硒依赖型蛋白．从已知的单细胞原生动物GPx氨基酸序列中可知，有大部分为非硒依赖型蛋白．硒的存在能够加速氢过氧化物的反应及GSH的还原[13]，说明含硒代半胱氨酸的GPx催化活性高于含半胱氨酸的GPx．根据GPx氨基酸序列的进化分析，组成GPx家族的3个进化组起源于含Cys的祖先[14]，E.vannus为低等原生动物，因此GPx在进化上保留了原始的CysGPx方式．

结果表明，GPx编码的多肽链无信号肽和潜在的N-糖基化位点，不属于分泌蛋白，且未形成跨膜结构域．推测原因为纤毛虫为单细胞生物，因此该蛋白作为胞内酶发挥生物学功能．氨基酸序列分析结果表明，该蛋白属于硫氧还蛋白超家族，为活性较低的CysGPx，与上面结果相符．进一步说明了本研究所克隆到的为GPx家族基因．同源性比较发现，E.vannusGPx氨基酸序列与植物的GPx氨基酸有一定的同源性．植物GPx可通过硫氧还蛋白系统，高效地还原过氧化物[15]，这种情况在原生动物恶性疟原虫中有发现[16]．最近研究表明，CysGPxs具有很高的反应速率，在植物同系物、酵母菌、原生生物和昆虫起源中均有发现是通过还原酶来发生还原反应[17]．因此虽然选择了非硒依赖型GPx，E.vannusGPx仍可通过硫氧还蛋白系统，高效还原过氧化物．

研究表明，GPx在重要生物环境中的作用已经远远超出了对氢过氧化物的解毒功能[18-19]，因此，了解纤毛虫的抗氧化酶与环境胁迫的关系，对于环境评价指标的筛选和应用具有重要作用．本研究首次从扇形游仆虫(Euplotesvannus)中克隆到了完整的GPx的cDNA，并对该基因序列，其编码的氨基酸序列特征、蛋白的理化性质、结构组成和功能结构域等进行了初步分析，将为进一步研究纤毛虫GPx基因的功能，深入了解纤毛虫抗氧化体系，以及探讨该基因与纤毛虫生长和各种胁迫应激反应之间的机制奠定基础．

致谢 感谢华南师范大学生命科学学院伊珍珍副教授和周亮、陈天兵以及吴磊等研究生的帮助．

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