吴攀峰，焦 铭，孙慧荣，吴基良，**

(1．武汉大学基础医学院药理系，湖北 武汉 430071；2.湖北科技学院糖尿病心脑血管病变湖北省重点实验室；3.武汉大学附属中南医院心内科)

铅是一种严重危害人类健康的重金属元素，会影响人体各系统的器官，主要是神经系统和造血系统[1]。更为严重的是铅影响婴幼儿的生长和智力发育，损伤认知功能、神经行为和学习记忆等脑功能，严重者造成痴呆[2]。目前认为铅能影响细胞外调节蛋白激酶(ERK)和蛋白激酶C的活性及表达，进而对大脑的学习记忆功能产生危害[3]。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是FGF家族中重要的生长因子类，在神经细胞的生长和发育中起着关键作用[4]。有研究表明，bFGF对老年性痴呆患者的皮肤成纤维细胞具有保护作用[5]。本实验利用经过bFGF和醋酸铅处理过的原代大鼠海马神经细胞，通过测定ERK活力的变化，来研究铅对神经元正常信号转导的影响以及bFGF对细胞中ERK活性的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料 新生1～3 d的SD大鼠(购于武汉大学动物实验中心，动物合格证号No.42000500001044)。Galaxy 170S型二氧化碳培养箱(美国Eppendorf有限公司)，LS-6500型液闪仪(美国Beckman公司)，UV-2550型紫外-可见分光光度计(岛津有限公司)等。多聚赖氨酸、ELK-1融合蛋白等购自Sigma公司。DMEM培养基购自美国Cellgro公司。bFGF购自麒宝生物科技有限公司。其余试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 大鼠海马神经元培养 选择新生1～3 d的SD大鼠，无菌条件下断头处死，取海马区脑组织，D-hank's液中剪碎，用0.125%胰酶在37 °C消化约20 min。用含10%胎牛血清的DMEM溶液终止消化，制成单细胞悬液并离心2次，细胞沉淀用培养基洗涤并悬浮，以2×109cell/L的细胞浓度加入已铺多聚赖氨酸的培养瓶中，在37 °C、5%二氧化碳培养箱中培养。24 h以后弃培养液，改为2% B27无血清培养液，每72 h半数更换培养液。

1.2.2 铅损伤神经元模型建立与分组 将培养的神经细胞用无血清DMEM培养基培养12 h，使细胞生长均一化，加入醋酸铅溶液，使染铅终浓度分别为0、0.1、0.5、1.0、2.0和4.0 μmol/L。另外预先用终浓度0.6 μg/L的bFGF处理细胞1 h，然后加入上述浓度的染铅溶液处理细胞30 min。细胞处理以后于-80 °C冰箱冻存。

1.2.3 胞浆中ERK活性的测定 采用改良的Takai法[6]，并用Lorry法检测蛋白质含量。牛血清白蛋白作为标准蛋白，绘制蛋白质浓度测量标准曲线。ERK活性以比活力表示，先测定ERK的基础活力(即未经过铅或bFGF处理)并除以ERK蛋白质量以标准化，再测经铅或bFGF处理后的ERK的活力并同样标准化，以后者比前者即得ERK比活力。每组检测5次。

2 结 果

2.1 不同染铅浓度对大鼠海马神经元ERK比活力的影响 将不同浓度醋酸铅(0、0.1、0.5、1.0、2.0、4.0 μmol/L)与海马原代神经细胞共同培养30 min后，在铅浓度为0～2.0 μmol/L之间，随铅浓度升高，ERK比活力也随之升高。在铅浓度2.0 μmol/L时，ERK比活力达到最大，为空白组的7.885倍；铅浓度上升到4.0 μmol/L后，ERK比活力随之降低，但是仍然高于空白组，如表1所示。

表1 不同染铅浓度对大鼠海马神经细胞ERK活力的影响

2.2 bFGF对不同染铅浓度大鼠海马神经元ERK活力的影响 预先用终浓度0.6 μg/L的bFGF处理海马神经细胞1h后，再加入不同浓度醋酸铅共同培育30 min，除染铅组1外各组的ERK活力与没有经过bFGF处理的细胞相比都有了不同程度的下降。在经过bFGF处理的不同染铅浓度组范围内，其ERK比活力与对照组(bFGF处理但没有染铅细胞组)相比无显著性差异，如表1所示。

3 讨 论

铅是常见的环境和工业污染物，长期暴露在低浓度铅环境会影响神经传导的正常功能，也会造成学习和记忆障碍[7]，但目前对铅影响细胞信号传导的机制还不是非常清楚。最新研究表明，铅能与铁竞争性的跟转铁蛋白结合，从而影响细胞内铁平衡，进而降低铁调节蛋白(iron regulatory protein，IRP)的表达[3]。而IRP是体内许多物质的调控因子，可以负反馈的调节ERK的含量[4]。所以，同本实验观察的现象一样，低浓度的醋酸铅可以调高ERK的活性，达到未加铅时的7.885倍。

bFGF是常见的细胞生长因子，可以有效的保护海马神经元，使其免遭损伤。实验结果证明，经过0.6 μg/L的bFGF处理海马神经细胞1 h后，在铅浓度为0.5 μmol/L及以上时与未经过bFGF预处理的染铅同浓度实验组相比ERK的活性明显降低，但是在铅浓度为0.1 μmol/L时，ERK活力升高明显，说明bFGF与铅产生了协同效应。而当铅浓度继续升高时，ERK活力增长缓慢，处于平台期，与正常ERK活力接近，说明了bFGF对染铅海马神经元的保护作用。但bFGF对神经元保护作用的具体机制还有待进一步研究，可能跟其影响ERK/MAPK信号途径有关。

[1]刘会芳，韩璇，郝俊生，等.川芎嗪注射液对铅中毒小鼠学习记忆功能及抗氧化能力的影响[J].时珍国医国药，2013，24(2)：328

[2] 郑光耀，许小芬，薄采颖，等.松针叶绿素-胡萝卜素软膏对染铅大鼠驱铅效果的初步研究[J].时珍国医国药，2012，23(4)：932

[3] Wang Q，Lin Y，Zhang W，et al.Lead induces dysregulation of iron regulatory protein 1 via the extracellular signal-regulated kinase pathway in human vascular endothelial cells[J].Brain Res，2012，1455：19

[4] Liu HZ，Luo P，Chen SH，et al.Basic fibroblast growth factor upregulates expression of growth hormone gene through extracellular signal-regulated kinase 1/2 in GH4 cells[J].Bratisl Lek Listy，2013，114(7)：376

[5] Bellucci C，Lilli C，Baroni T，et al.Differences in extracellular matrix production and basic fibroblast growth factor response in skin fibroblasts from sporadic and familial Alzheimer's disease[J].Mol Med，2007，13(9-10)：542

[6] 孙黎光，朱延松，等.铅对大鼠海马神经元胞质PKC活性的影响[J].中国医科大学学报，2002，31(5)：326

[7] 唐瑜，贾庆华，马平，等.铅致原代培养海马神经元凋亡及Bcl-2、Bax、p53和NOS1基因表达的影响[J].卫生研究，2010，39(2)：235