桓明辉等

摘要：为促进秸秆还田，加快秸秆在北方设施土壤中的降解速度，以腐烂秸秆为待筛菌株原料，以玉米秸秆粉为培养基，在15℃低温条件下，采用刚果红平板法进行初筛，得到16株菌株，对16株菌株进行酶活测定复筛，其中L-13酶活最高，达1 679.61 U/ml。对L-13菌株的菌体形态、菌落特征进行观察，并进行了一系列生理生化试验和16S rDNA 序列分析，初步鉴定L-13为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。此菌可以在15℃下快速生长繁殖并高产纤维素酶，低温条件下能快速降解秸秆。

关键词：玉米秸秆；低温；纤维素酶

中图分类号：Q93-331 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2014）03-0054-04

AbstractIn order to promote straw returning and speed up its degradation in the North greenhouse soil， using rotten straw as raw materials and corn straw powder as medium， 16 strains were isolated with Congo Red plate method at 15℃. Then the enzyme activities of 16 strains were detected. L-13 had the highest enzyme activity of 1 679.61 U/ml. The mycelial morphology and colony characteristics of L-13 were observed， and a series of physiological and biochemical tests and 16S rDNA sequence analysis were conducted. The L-13 strain was preliminarily identified as Bacillus subtilis.Owing to growing fastly and high yielding of cellulase at 15℃，it could degrade the straw under low temperature rapidly.

Key wordsCorn straw； Low temperature； Cellulase

我国的玉米秸秆资源分布较广，是一种易得的可再生生物资源。目前秸秆的主要用途是秸秆还田和制备粗饲料，但用量总和不足秸秆总量的40%，其余则被焚烧掉，造成了极大的资源浪费和环境污染。为了进一步提高秸秆的利用率，加快秸秆的降解速度，尤其是低温条件下的降解效率，以满足北方冬季设施秸秆还田的需要，本试验在低温（15℃）环境下，筛选出了玉米秸秆低温快速腐熟菌，并进行了菌株鉴定，以期为北方冬季设施秸秆还田提供科学依据。

1材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1材料玉米秸秆，采自朝阳市郊区，粉碎后用于腐熟菌的筛选。

1.1.2试剂0.05 mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液；3，5-二硝基水杨酸显色液（DNS）；0.5%羧甲基纤维素钠溶液；0.2 mg/ml纤维素酶；2 mol/L盐酸溶液。

1.1.3培养基分离培养基：玉米秸秆粉20 g，琼脂20 g，水1 000 ml，121℃灭菌30 min，备用。筛选培养基：刚果红纤维素钠培养基，见《微生物学实验》。液体发酵培养基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，水1 000 ml，pH 7.0～7.2，121℃灭菌30 min，备用。生理生化鉴定培养基及试剂见《常见细菌系统鉴定手册》。

1.1.4仪器设备高速冷冻离心机、凝胶成像系统、恒温水浴锅、PCR仪、电泳仪、恒温培养箱、731型分光光度计等。

1.2试验方法

1.2.1低温降解纤维素菌株的分离将腐烂的玉米秸秆（含待筛菌株）粉碎，取0.5 g加入49.5 ml无菌水，置于振荡器上振荡30 min，后吸取1 ml加入9 ml无菌水，以此类推，共稀释到10-9。

吸取0.1 ml不同倍数稀释液于筛选培养基上，涂平板，15℃低温条件下培养，直到形成单菌落。

1.2.2低温降解纤维素菌株初筛将所得单菌落分别挑到刚果红纤维素钠平板中，每个平皿一种菌株，重复3次，15℃恒温箱中倒置培养48 h。观察平板，标记有水解圈的菌株、测量水解圈直径并记录试验结果。

1.2.3低温降解纤维素菌株复筛原样酶液制备：将初筛所得菌株分别转接到液体发酵培养基中，15℃培养48 h，取发酵液 1 ml于EP管中，10 000 r/min离心10 min，上清液即为原样酶液。

DNS法测酶活力：取3支容量为20.0 ml的试管，一支做空白对照，其余2支做平行样品管。取1.0 ml原样酶液加入样品管中，后向3支试管中分别加入4.0 ml预热至60℃的底物溶液，60℃水浴准确计时20 min取出，立即加入1.0 ml 2.0 mol/L的氢氧化钠溶液和2.0 ml DNS显色液，摇匀，在对照管中再加入1.0 ml原样酶液，后将3支试管置于沸水浴准确计时显色5 min取出，流水迅速冷却，并用蒸馏水定容至20.0 ml，摇匀后用分光光度计测定490 nm处吸光度值。定义每分钟产生1 μg葡萄糖为一个酶活单位。

纤维素酶活计算：U=M1-M0/20

式中，U为样品的酶活力，单位为微克每分钟（μg/min）；M0为对照葡萄糖量，单位为微克（μg）；M1为分解后样品质量，单位为微克（μg）；20为酶与底物反应时间，单位为分钟（min）。

1.3菌种鉴定

1.3.1菌株形态和生理生化鉴定根据菌株的菌落形态特征、菌体形态特征、革兰氏染色性状、芽孢染色性状及有关生理生化鉴别试验，参照《常见细菌系统鉴定手册》、《伯杰细菌鉴定手册》进行属和种的鉴定。

菌株形态鉴定：将复筛得到L-13菌株进行10倍梯度稀释，取10-4、10-5稀释液于分离培养基上涂平板，15℃培养48 h得单菌落，观察记录菌落形状和大小、边缘、表面、隆起形状、透明度、菌落及培养基的颜色等。另挑取15℃培养24 h的菌株，参照《常见细菌系统鉴定手册》进行革兰氏染色，显微镜下观察其菌体形态，并进行芽孢、鞭毛染色。

生理生化鉴定：参照《常见细菌系统鉴定手册》对菌株进行生理生化试验。主要进行H2S 产生试验、吲哚试验、明胶液化试验、过氧化氢酶（接触酶）试验、精氨基脱羧酶试验、淀粉水解、V.P（乙酰甲基甲醇）试验、M.R（甲基红）试验、柠檬酸盐试验、酪素水解、糖、醇发酵试验、苯丙氨酸脱氨酶试验、纤维素水解试验、脲酶（尿素水解）试验、丙二酸盐试验、硝酸盐还原试验和3-酮基乳糖试验。

1.3.216S rDNA鉴定DNA提取和16S rDNA扩增：参考Kim等和Rainey等方法提取细菌总DNA。1%琼脂糖电泳检测。引物为通用引物：27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1495R（5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′）。 PCR 反应体系：DNA模板（70 ng/μl）2 μl；dNTP Mix（2.5 mmol/L）2.5 μl；27F（20 μmol/L）1.5 μl；1495 R（20 μmol/L）1.5 μl；10×Ex Taq Buffer（Mg2+ pluse）5 μl；Ex Taq DNA 聚合酶0.2 μl；补足ddH2O到50 μl。PCR条件：94℃预变性3 min； 94℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸3 min，30个循环；最后72℃延伸5 min。PCR产物经试剂盒纯化后，送大连宝生物工程技术服务有限公司测序。

16S rDNA序列分析及系统发育树构建：将测得的16S rDNA序列用BLAST软件与GenBank数据库进行相似性分析，将所得相近序列利用 Clustal X（1.8）进行多重序列比对（Multiple alignments），并用Neighbor-Joining 法构建系统发育树。

2结果与分析

2.1低温降解纤维素菌株的筛选

2.1.1低温降解纤维素菌株的初筛经初筛得到产纤维素酶的菌株16株，分别命名为L-1～L-16（表1），水解圈直径为15.2～35.3 mm，其中L-13水解圈直径最大，为35.3 mm。

3结论

利用刚果红纤维素钠初筛、纤维素酶活复筛，从腐熟秸秆粉中筛选出一株低温条件下能够快速降解玉米秸秆的菌株L-13，根据其形态、生理生化特性及16S rDNA序列分析结果，初步鉴定为枯草芽孢杆菌。北方冬季（12～2月）设施地温低，多在12～20℃之间，低温条件下能够快速生长并高产纤维素酶的L-13菌种有一定的应用前景。

参考文献：

[1]

顿宝庆，吴薇，王旭静，等.一株高纤维素酶活力纤维素分解菌的分离与鉴定[J].中国农业科技导报，2008，10（1）：113-117.

[2]陈合，张强.菌酶共降解玉米秸秆的工艺研究[J].农业工程学报， 2008，24（3）：270-273.

[3]韩学易，陈惠，吴琦，等.产纤维素酶枯草芽孢杆菌 C-36 的产酶条件研究[J].四川农业大学学报，2006，24（2）：179-181.

[4]燕红，杨谦，潘忠诚.一株地衣芽孢杆菌对稻草降解作用的研究[J].浙江大学学报，2007，33（4）：360-366.

[5]祝小，耿秀蓉，潘康成，等.枯草芽孢杆菌 Pab02 产纤维素酶活性的研究[J].饲料研究，2007（1）：61-63.

[6]东秀珠，蔡妙英. 常见细菌系统鉴定手册[M].北京：科学出版社， 2001.

[7]霍尔特J G.伯杰细菌鉴定手册[M]. 刘复今，编译. 简明第8版.济南：山东大学出版社， 1988.

[8]Kim S B， Yoon J H， Kim H， et al. A phylogenetic analysis of the genus Saccharomonospora conducted with 16S rRNA gene sequences [J]. International Journal of Systematic Bacteriology， 1995， 45（2）： 351-356.

[9]Rainey F A， Rainey N W， Kroppenstedt R M， et al. The genus Nocardiopsis represents a phylogenetically coherent taxon and a distinct actinomycete lineage： Proposal of Nocardiopsaceae fam. nov. [J]. International Journal of Systematic Bacteriology， 1996， 46（4）： 1088-1092.

1.3菌种鉴定

1.3.1菌株形态和生理生化鉴定根据菌株的菌落形态特征、菌体形态特征、革兰氏染色性状、芽孢染色性状及有关生理生化鉴别试验，参照《常见细菌系统鉴定手册》、《伯杰细菌鉴定手册》进行属和种的鉴定。

菌株形态鉴定：将复筛得到L-13菌株进行10倍梯度稀释，取10-4、10-5稀释液于分离培养基上涂平板，15℃培养48 h得单菌落，观察记录菌落形状和大小、边缘、表面、隆起形状、透明度、菌落及培养基的颜色等。另挑取15℃培养24 h的菌株，参照《常见细菌系统鉴定手册》进行革兰氏染色，显微镜下观察其菌体形态，并进行芽孢、鞭毛染色。

生理生化鉴定：参照《常见细菌系统鉴定手册》对菌株进行生理生化试验。主要进行H2S 产生试验、吲哚试验、明胶液化试验、过氧化氢酶（接触酶）试验、精氨基脱羧酶试验、淀粉水解、V.P（乙酰甲基甲醇）试验、M.R（甲基红）试验、柠檬酸盐试验、酪素水解、糖、醇发酵试验、苯丙氨酸脱氨酶试验、纤维素水解试验、脲酶（尿素水解）试验、丙二酸盐试验、硝酸盐还原试验和3-酮基乳糖试验。

1.3.216S rDNA鉴定DNA提取和16S rDNA扩增：参考Kim等和Rainey等方法提取细菌总DNA。1%琼脂糖电泳检测。引物为通用引物：27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1495R（5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′）。 PCR 反应体系：DNA模板（70 ng/μl）2 μl；dNTP Mix（2.5 mmol/L）2.5 μl；27F（20 μmol/L）1.5 μl；1495 R（20 μmol/L）1.5 μl；10×Ex Taq Buffer（Mg2+ pluse）5 μl；Ex Taq DNA 聚合酶0.2 μl；补足ddH2O到50 μl。PCR条件：94℃预变性3 min； 94℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸3 min，30个循环；最后72℃延伸5 min。PCR产物经试剂盒纯化后，送大连宝生物工程技术服务有限公司测序。

16S rDNA序列分析及系统发育树构建：将测得的16S rDNA序列用BLAST软件与GenBank数据库进行相似性分析，将所得相近序列利用 Clustal X（1.8）进行多重序列比对（Multiple alignments），并用Neighbor-Joining 法构建系统发育树。

2结果与分析

2.1低温降解纤维素菌株的筛选

2.1.1低温降解纤维素菌株的初筛经初筛得到产纤维素酶的菌株16株，分别命名为L-1～L-16（表1），水解圈直径为15.2～35.3 mm，其中L-13水解圈直径最大，为35.3 mm。

3结论

利用刚果红纤维素钠初筛、纤维素酶活复筛，从腐熟秸秆粉中筛选出一株低温条件下能够快速降解玉米秸秆的菌株L-13，根据其形态、生理生化特性及16S rDNA序列分析结果，初步鉴定为枯草芽孢杆菌。北方冬季（12～2月）设施地温低，多在12～20℃之间，低温条件下能够快速生长并高产纤维素酶的L-13菌种有一定的应用前景。

参考文献：

[1]

顿宝庆，吴薇，王旭静，等.一株高纤维素酶活力纤维素分解菌的分离与鉴定[J].中国农业科技导报，2008，10（1）：113-117.

[2]陈合，张强.菌酶共降解玉米秸秆的工艺研究[J].农业工程学报， 2008，24（3）：270-273.

[3]韩学易，陈惠，吴琦，等.产纤维素酶枯草芽孢杆菌 C-36 的产酶条件研究[J].四川农业大学学报，2006，24（2）：179-181.

[4]燕红，杨谦，潘忠诚.一株地衣芽孢杆菌对稻草降解作用的研究[J].浙江大学学报，2007，33（4）：360-366.

[5]祝小，耿秀蓉，潘康成，等.枯草芽孢杆菌 Pab02 产纤维素酶活性的研究[J].饲料研究，2007（1）：61-63.

[6]东秀珠，蔡妙英. 常见细菌系统鉴定手册[M].北京：科学出版社， 2001.

[7]霍尔特J G.伯杰细菌鉴定手册[M]. 刘复今，编译. 简明第8版.济南：山东大学出版社， 1988.

[8]Kim S B， Yoon J H， Kim H， et al. A phylogenetic analysis of the genus Saccharomonospora conducted with 16S rRNA gene sequences [J]. International Journal of Systematic Bacteriology， 1995， 45（2）： 351-356.

[9]Rainey F A， Rainey N W， Kroppenstedt R M， et al. The genus Nocardiopsis represents a phylogenetically coherent taxon and a distinct actinomycete lineage： Proposal of Nocardiopsaceae fam. nov. [J]. International Journal of Systematic Bacteriology， 1996， 46（4）： 1088-1092.

1.3菌种鉴定

1.3.1菌株形态和生理生化鉴定根据菌株的菌落形态特征、菌体形态特征、革兰氏染色性状、芽孢染色性状及有关生理生化鉴别试验，参照《常见细菌系统鉴定手册》、《伯杰细菌鉴定手册》进行属和种的鉴定。

菌株形态鉴定：将复筛得到L-13菌株进行10倍梯度稀释，取10-4、10-5稀释液于分离培养基上涂平板，15℃培养48 h得单菌落，观察记录菌落形状和大小、边缘、表面、隆起形状、透明度、菌落及培养基的颜色等。另挑取15℃培养24 h的菌株，参照《常见细菌系统鉴定手册》进行革兰氏染色，显微镜下观察其菌体形态，并进行芽孢、鞭毛染色。

生理生化鉴定：参照《常见细菌系统鉴定手册》对菌株进行生理生化试验。主要进行H2S 产生试验、吲哚试验、明胶液化试验、过氧化氢酶（接触酶）试验、精氨基脱羧酶试验、淀粉水解、V.P（乙酰甲基甲醇）试验、M.R（甲基红）试验、柠檬酸盐试验、酪素水解、糖、醇发酵试验、苯丙氨酸脱氨酶试验、纤维素水解试验、脲酶（尿素水解）试验、丙二酸盐试验、硝酸盐还原试验和3-酮基乳糖试验。

1.3.216S rDNA鉴定DNA提取和16S rDNA扩增：参考Kim等和Rainey等方法提取细菌总DNA。1%琼脂糖电泳检测。引物为通用引物：27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1495R（5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′）。 PCR 反应体系：DNA模板（70 ng/μl）2 μl；dNTP Mix（2.5 mmol/L）2.5 μl；27F（20 μmol/L）1.5 μl；1495 R（20 μmol/L）1.5 μl；10×Ex Taq Buffer（Mg2+ pluse）5 μl；Ex Taq DNA 聚合酶0.2 μl；补足ddH2O到50 μl。PCR条件：94℃预变性3 min； 94℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸3 min，30个循环；最后72℃延伸5 min。PCR产物经试剂盒纯化后，送大连宝生物工程技术服务有限公司测序。

16S rDNA序列分析及系统发育树构建：将测得的16S rDNA序列用BLAST软件与GenBank数据库进行相似性分析，将所得相近序列利用 Clustal X（1.8）进行多重序列比对（Multiple alignments），并用Neighbor-Joining 法构建系统发育树。

2结果与分析

2.1低温降解纤维素菌株的筛选

2.1.1低温降解纤维素菌株的初筛经初筛得到产纤维素酶的菌株16株，分别命名为L-1～L-16（表1），水解圈直径为15.2～35.3 mm，其中L-13水解圈直径最大，为35.3 mm。

3结论

利用刚果红纤维素钠初筛、纤维素酶活复筛，从腐熟秸秆粉中筛选出一株低温条件下能够快速降解玉米秸秆的菌株L-13，根据其形态、生理生化特性及16S rDNA序列分析结果，初步鉴定为枯草芽孢杆菌。北方冬季（12～2月）设施地温低，多在12～20℃之间，低温条件下能够快速生长并高产纤维素酶的L-13菌种有一定的应用前景。

参考文献：

[1]

顿宝庆，吴薇，王旭静，等.一株高纤维素酶活力纤维素分解菌的分离与鉴定[J].中国农业科技导报，2008，10（1）：113-117.

[2]陈合，张强.菌酶共降解玉米秸秆的工艺研究[J].农业工程学报， 2008，24（3）：270-273.

[3]韩学易，陈惠，吴琦，等.产纤维素酶枯草芽孢杆菌 C-36 的产酶条件研究[J].四川农业大学学报，2006，24（2）：179-181.

[4]燕红，杨谦，潘忠诚.一株地衣芽孢杆菌对稻草降解作用的研究[J].浙江大学学报，2007，33（4）：360-366.

[5]祝小，耿秀蓉，潘康成，等.枯草芽孢杆菌 Pab02 产纤维素酶活性的研究[J].饲料研究，2007（1）：61-63.

[6]东秀珠，蔡妙英. 常见细菌系统鉴定手册[M].北京：科学出版社， 2001.

[7]霍尔特J G.伯杰细菌鉴定手册[M]. 刘复今，编译. 简明第8版.济南：山东大学出版社， 1988.

[8]Kim S B， Yoon J H， Kim H， et al. A phylogenetic analysis of the genus Saccharomonospora conducted with 16S rRNA gene sequences [J]. International Journal of Systematic Bacteriology， 1995， 45（2）： 351-356.

[9]Rainey F A， Rainey N W， Kroppenstedt R M， et al. The genus Nocardiopsis represents a phylogenetically coherent taxon and a distinct actinomycete lineage： Proposal of Nocardiopsaceae fam. nov. [J]. International Journal of Systematic Bacteriology， 1996， 46（4）： 1088-1092.