朱平川，岑卫健，范晓苏

（1.亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室（广西大学），广西 南宁530004；2.广西大学化学化工学院，广西 南宁530004）

王老吉凉茶是著名的广东凉茶之一，由金银花、菊花、仙草、鸡蛋花、夏枯草、布渣叶和甘草7味药材组成，具有清热解毒、凉血排毒等功效.2006年国务院将凉茶批准为国家级非物质文化遗产［1］.凉茶中含有多种中药有效成分，绿原酸具有显著的抗氧化、降血糖血压以及抗菌消炎、抗肿瘤等多种药理活性［2］，异绿原酸具有抗菌、抗炎、促凝血、抗氧化以及降血脂等作用［3］，甘草酸属于皂苷类成分，甘草酸能达到增加人体免疫功能作用［4］，但目前对凉茶中药有效成分的报道比较少，且大多采用液相色谱法［5］.曹英华等采用高效液相色谱法测定［6］凉茶中绿原酸、新橙皮苷、甘草酸的含量，邓洁薇［7］对邓老凉茶颗粒进行了的HPLC指纹图谱研究.在凉茶以及其他饮料中的绿原酸、异绿原酸C、甘草酸这3种物质含量的同时分析研究尚少见有报道.

色谱-质谱联用技术具有专属灵敏、快速等特点，已成功用于成分测定［8］，液相色谱-质谱联用技术更是成分分析中定性和定量分析的有力工具［9-10］，并且越来越广泛地运用于食品与饮料中的成分研究［11］，本工作建立了采用超高效液相色谱-串联质谱法同时检测这3种物质含量的方法，该方法准确、简便快速，已成功地用于实际样品的分析.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂 仪器：1290Infinity LC System，6460Triple Quad LC／MS，美国Agilent公司；ME 215S电子天平，德国Sartorius公司；Eppendorf Centrifuge 5810R台式高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司；Synthesis A10TM超纯水系统，美国Millipore公司；KQ2200DV超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司.试剂：甲醇、乙腈、甲酸（色谱纯），美国Fisher公司，对照品绿原酸、异绿原酸C、甘草酸（四川省维克奇生物科技有限公司），实验用水为超纯水；样品王老吉凉茶（广州王老吉健康产业有限公司）.

1.2 溶液配制 对照品储备液：准确称取绿原酸、异绿原酸C、甘草酸对照品各10.0mg，分别用甲醇溶解并定容至10mL容量瓶中，配成1.00mg／mL储备液，于4℃下保存，使用前用甲醇稀释到所需的浓度.

样品溶液：准确量取王老吉凉茶1mL，用甲醇稀释10倍，取稀释的样品1mL置于1.5mL的EP管中，于12 000rpm下离心10min，经0.22μm的微孔过滤膜过滤即可作为样品溶液.

1.3 色谱条件 采用 Agilent Zorbax RRHD Eclipse Plus C18（2.1×50.0mm，1.8μm）色谱柱；以含甲醇（A）-0.1%甲酸的水溶液（B）为流动相，梯度洗脱程序：0～3min，90%～55%B；3.0～4.5min，55%～30%B；4.5～6.0min，30%～10%B；6～8min，10%～0%B；8～9min，0%B；9～10min，0%～90%B.流速为0.30mL／min，进样量：1μL.

1.4 质谱条件 离子源为电喷雾电离源，干燥气体，雾化气体，鞘气气体均为N2，毛细管电压为4 000 V，喷嘴电压为0V.采用多重反应监测模式（MRM），3种目标组分的其他质谱分析参数见表1.

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化 对甲醇-水和乙腈-水流动相进行了考察，结果表明使用甲醇-水体系作流动相时灵敏度高于乙腈-水体系，且分离效果更好.当流动相中不添加甲酸时，绿原酸、异绿原酸C两个物质峰有严重的拖尾，且同时发现添加的甲酸的浓度会影响各组分的检测灵敏度，本方法采用在流动相甲醇-0.1%甲酸水为流动相进行梯度洗脱.

2.2 质谱条件的优化 分别对比了正离子和负离子检测模式，发现在实验条件下采用绿原酸、异绿原酸C在负离子模式下检测灵敏度高，而甘草酸在正离子模式的检测灵敏度较高.在MRM模式下，对选定的各待测物的母离子和定量子离子进行各种参数的优化，结果见表1.

表1 3种成分的部分质谱分析参数

2.3 色谱与质谱行为 在优化的色谱质谱条件下，被测组分间可获得良好的分离，色谱图见1.根据峰的保留时间及质谱信息进行定性，二级质谱特征离子图谱见图2.从图2中，可以看出绿原酸、异绿原酸C分子离子峰为［M-H］-、甘草酸的分子离子峰为［M＋Na］＋；从图2中选出各物质响应最强且稳定的子离子作为定量子离子，因此进行多重反应监测时，分别对绿原酸（m／z为191.1）、异绿原酸C（m／z为353.0）、甘草酸（m／z为669.3）的碎片离子进行监测.

图1 对照品（A）和样品（B）的MRM色谱图

图2 3种标准品的二级质谱图

表2 3种组分的线性方程、相关系数、线性范围及检出限

2.4 线性关系及检出限精密吸取3种对照品的储备液，甲醇溶液稀释，配制一系列不同质量浓度的对照品，混合，在优化的实验条件下测定，重复3次.以被测组分质量浓度为横坐标，峰面积的平均值为纵坐标进行线性回归，以信噪比（S／N）等于3为标准，测得3种待测组分的检出限，见表2，从表中可看出，各化合物的响应值与浓度间均呈现良好的线性关系.

2.5 精密度、稳定性以及重复性 取同一批次待测样品，按“1.2”下供试样品溶液的方法制备样品溶液，在优化的实验条件下连续进样6次测定，相对标准偏差（RSD）为1.2%～1.8%，结果表明该方法有较好的精密度.

取同一批次样品，按“1.2”下供试样品溶液的方法制备样品溶液，在优化后的实验条件下，分别于0，2，4，6，8，10h进样测定，相对标准偏差（RSD）为1.3%～2.1%，结果表明供试品溶液在10h内稳定.

同一批次待测样品随机取6份，按“1.2”下供试样品溶液的方法制备样品溶液，在优化的实验条件下分析，相对标准偏差（RSD）为1.6%～2.5%.结果表明供试样品重复性良好.

2.6 加标回收率试验 分别精密量取已知这3种组分含量的同一批次王老吉凉茶各1mL，共9份，每组3份，按“1.2”供试样品溶液的制备方法将样品稀释10倍来制备样品溶液，加入高、中、低3个质量浓度的混合标准品.在最优化实验条件下分析.3种成分的平均回收率根据峰面积代入回归方程计算得出，具体数据见表3.在添加3个质量浓度的水平下，3种成分的加标回收率为94.7%～103%，RSD均不大于1.9%，可以满足实际样品的测定要求.

表3 3种组分在样品中的加标回收率（n＝3）

2.7 样品分析 分别精密称取不同批次的样品，按“1.2”下供试样品溶液的方法制备样品溶液，按上述优化好的条件进行样品测定，把各组分峰面积代入回归方程计算得到样品中3种组分的含量，结果见表4.实验结果表明，该方法可用于绿原酸、异绿原酸C、甘草酸3种有效成分含量的同时测定.

表4 样品测定结果

3 结论

采用UPLC-MS／MS技术建立了同时测定王老吉凉茶中绿原酸、异绿原酸C、甘草酸3种药效成分含量的分析方法.实验结果表明，该方法具有灵敏度好、定量能力强、准确度高、快速、简单的特点，已成功用于王老吉凉茶中上述3种有效成分含量的同时测定，可以为王老吉凉茶的质量控制和中草药疗效以及药代动力学等相关研究提供新的参考方法.

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