孟静静等

摘要：盆栽条件下，研究了轻度镉胁迫下施用不同浓度枯草芽孢杆菌对花育31号花生生理性状、植株性状和籽粒镉积累量的影响。结果表明，施用枯草芽孢杆菌能提高花生苗期、花针期和成熟期的叶片叶绿素含量和根系活力，降低叶片相对电导率；施用量为2 g/kg和4 g/kg时均能显著提高不同生育期叶片的SOD活性和POD活性，显著降低叶片MDA含量；1 g/kg和2 g/kg枯草芽孢杆菌均能较大幅度提高花生主茎高、侧枝长、植株鲜重、单株果重和饱果率，均能显著减少籽粒镉的积累量。综上，施用2 g/kg枯草芽孢杆菌对缓解花生轻度镉胁迫的效果最好，能显著提高叶绿素含量和根系活力，降低镉胁迫对细胞膜的损坏程度，显著增加单株果重和饱果率，籽粒镉积累量降低25.37%。

关键词：花生；枯草芽孢杆菌；镉胁迫；生理特性；产量

中图分类号：S565.201 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2014）03-0017-05

AbstractThe pot experiment was carried out to study the effects of applying different concentrations of Bacillus subtilis on the physiological and plant characters， and cadmium content in seeds under mild cadmium stress. The results showed that applying Bacillus subtilis could improve the leaf chlorophyll content and root activity， reduce relative conductivity in leaves of peanut at seedling stage， flowering stage and mature stage.Applying 2 g/kg and 4 g/kg Bacillus subtilis could both significantly increase the SOD and POD activities，significantly reduce the MDA content in leaves at different growth periods. Applying 1 g/kg and 2 g/kg Bacillus subtilis could obviously improve stem height， lateral branch length， plant fresh weight， fruit weight per plant and plump rate， significantly reduce the cadmium accumulation in seeds. This study showed that applying 2 g/kg Bacillus subtilis had the best effects of relieving mild cadmium stress on peanut. The chlorophyll content and root activity were significantly increased， the damage of cadmium stress on cytomembrane was decreased， the fruit weight per plant and plump rate were significantly increased， and the cadmium accumulation in seeds was decreased by 25.37%.

Key wordsPeanut； Bacillus subtilis； Cd stress； Physiological characters； Yield

花生是一种对重金属镉吸收能力较强的食油兼用作物，我国是世界上重要的花生生产和出口国。近年来，籽粒镉含量偏高已成为制约我国花生出口的重要因素[1]。镉被作物大量吸收后会出现重金属毒害症状，不同作物对Cd的反应不一致，一般会导致叶片失绿、生长迟缓、植株矮化、生物量降低等[2]。花生开花期根和叶的细胞膜透性是对Cd胁迫响应最敏感的生理参数[3]。另外，Cd胁迫还会导致花生株高降低，根长和侧根数减少，超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）活性降低等[4]。

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是土壤和植物微生态的优势种群，因其能忍受极端环境，并通过分泌抗生物质竞争生长，在防治作物病虫害方面发挥了重要作用，已作为生防微生物在农业生产中进行推广应用，但其对花生籽粒镉积累和生理性状的影响鲜有报道。本研究选择花育31号为供试材料，研究了轻度镉胁迫下枯草芽孢杆菌对花生生长、籽粒镉积累、叶绿素含量、根系活力、叶片相对电导率等的影响，探究利用枯草芽孢杆菌降低花生镉积累、增强花生抗镉胁迫的能力，为花生安全生产提供指导。

1材料与方法

1.1供试材料

供试花生品种为花育31号，由山东省花生研究所提供。枯草芽孢杆菌孢子干粉由山东省农业科学院生物技术研究中心提供。试验采用泥陶盆（内径38 cm×高28 cm）。盆栽所用复合肥：N+P2O5+K2O≥42%，未检测出镉。盆栽土壤选用山东省农业科学院试验地耕层土壤（0～20 cm），土壤有机质17.8 g/kg，碱解氮75.8 mg/kg，有效磷10.2 mg/kg，有效钾98.2 mg/kg，pH 7.10，阳离子交换量16.54 cmol/kg，总Cd浓度 0.048 mg/kg。

1.2试验设计

盆栽试验在山东省农业科学院试验场防雨棚进行。先将土壤过1 cm孔筛，每盆装土15 kg。氯化镉溶解后，加入土壤并拌匀，土壤Cd浓度为1.0 mg/kg，平衡30 d。每盆施入复合肥30 g，充分混匀。将枯草芽孢杆菌粉末以0、1、2和4 g/kg的施入量掺入到土壤中，每处理20盆。精选大小一致的花生种子种植盆中，每盆3粒。

于苗期、花针期、成熟期，选择受光方向一致的主茎倒3叶取样，一部分样品放入冰盒中用于叶绿素含量和细胞膜透性测定，另一部分迅速放入液氮罐中带回室内，于-40℃低温冰箱中保存，用于保护酶活性测定。同时取根，放入冰盒中用于根系活力测定。于收获期取植株和荚果。

1.3测定项目与方法

1.3.1叶绿素含量测定采用Arnon法[5]，紫外分光光度计测吸光度。

1.3.2叶片细胞膜透性测定取花生叶片0.1 g置于具塞试管中，加入15 ml 1%吐温80，真空泵抽气10 min，缓慢放气。室温振荡60 min，用电导率仪测定其初电导率。再放入沸水浴20 min，冷却后再次测定其终电导率。以相对电导率表示电解质渗出率。

1.3.3根系活力测定TTC还原法[6]测定根系活力。

1.3.4SOD、POD活性和MDA含量测定参照王爱国[7]的方法测定SOD活性；参照愈创木酚法[8]测定POD活性；参照林植芳[9]的方法测定MDA。

1.3.5Cd含量测定采用原子吸收分光光度计法。

1.4数据处理与分析

用DPS7.05统计软件进行方差分析、显著性检验，用Microsoft Excel软件进行图表制作。

2结果与分析

2.1枯草芽孢杆菌对花生生长、产量及Cd积累的影响

2.1.1对花生生长的影响表1表明，适当施用枯草芽孢杆菌可提高花生主茎高、侧枝长和生物量。其中2 g/kg处理效果最显著，其主茎高、侧枝长、植株鲜重和植株干重分别比对照增加了13.54%、18.10%、10.80%和19.35%。

3讨论与结论

Cd污染土壤对植物的影响是多方面的，通过根系的吸收，Cd能改变叶绿体、线粒体等细胞器的结构与功能，从而影响植物的生理代谢活动，给生长发育带来不利影响[11]。此外，Cd可通过食物链等途径直接或间接危害动物和人类的健康[12]。植物叶绿体是较易积累镉的细胞器之一，镉能抑制叶绿素的生物合成[13]。刘文龙等[3]认为不同品种花生叶绿素含量随镉浓度增加而降低的幅度和速度存在明显的差异。高芳等[14]研究显示豫花15叶绿素含量对镉敏感，轻度镉胁迫即可降低其含量。本研究结果表明，枯草芽孢杆菌可以明显缓解轻度Cd胁迫对花生叶绿素含量的影响，施用量越大效果越明显。

Cd浓度在不高于60 mg/L范围内，随着营养液Cd浓度的增大，花生叶绿素含量和根氧化活力极显著降低，根、叶细胞膜透性和丙二醛含量极显著增加[3]。本研究结果表明，枯草芽孢杆菌能明显缓解Cd胁迫对花生叶片相对电导率和根系活力的影响，在花针期效果较明显。花生叶片SOD活性随枯草芽孢杆菌用量增加呈先升高后降低趋势，POD活性呈先降低再升高趋势，MDA含量随枯草芽孢杆菌用量增加而降低。说明适量的枯草芽孢杆菌不仅可以增强抗氧化酶的活性，而且还能减轻膜脂过氧化作用，缓解了Cd对花生的胁迫作用。

镉胁迫降低花生的产量，主要是降低了出仁率和单株荚果数[14]。施用枯草芽孢杆菌可促进花生生长，有效增加花生的主茎高、侧枝长、植株生物量，提高花生产量，2 g/kg处理明显增加了花生的单株果重和饱果率。枯草芽孢杆菌抑制花生籽粒中的Cd积累，其中2 g/kg处理效果最好。我国土壤中镉的卫生标准为1.0 mg/kg（也是本研究设定的依据），即使未达到污染水平，但是生态风险依然存在，在此含量水平下，花生籽粒镉含量为2.0 mg/kg，尽管施用枯草芽孢杆菌使花生籽粒镉积累量降低约25%，但仍超过0.5 mg/kg国家标准（GB15201-1994）的2倍还多，可见镉污染极具隐蔽性，由此带来的花生食品安全风险不容忽视，未来应加强花生镉污染控制技术研究。

参考文献：

[1]万书波， 单世华，李春娟，等. 我国花生安全生产现状与策略[J]. 花生学报， 2005， 34（1）：1-4.

[2]张欣， 范仲学， 郭笃发， 等. 外源物质对农作物镉毒害的缓解效应[J]. 山东农业科学， 2011（1）：68-72.

[3]刘文龙， 王凯荣， 王铭伦. 花生对镉胁迫的生理响应及品种间差异 [J]. 应用生态学报， 2009， 20（2）： 451-459.

[4]高芳. 镉对花生生理特性、产量品质的影响及其钙素调控 [D]. 泰安：山东农业大学， 2011.

[5]Arnon D I. Copper enzymes in isolated chloroplast， polyphenoloxidase in Beta vulgari [J]. Plant Physiol.， 1949（24）：1-5.

[6]李合生. 植物生理生化实验原理和技术 [M]. 北京： 高等教育出版社， 2000：119-120.

[7]王爱国， 罗广华， 邵从本， 等. 大豆种子超氧化物歧化酶的研究 [J]. 植物生理学， 1983， 9（1）： 77-83.

[8]华东师范大学. 植物生理学实验指导 [M]. 北京：人民教育出版社， 1980.

[9]林植芳， 李双顺， 林桂珠， 等. 水稻叶片的衰老与超氧化物歧化酶活性及脂质过氧化作用的关系 [J]. 植物学报， 1984， 26（6）： 605-615.

[10]王凯荣， 张磊. 花生镉污染研究进展[J]. 应用生态学报， 2008， 19（12）： 2757-2762.

[11]Clemens S. Toxic metal accumulation， responses to exposure and mechanisms of tolerance in plants [J]. Biochimie， 2006， 88（11）： 1707-1719.

[12]Deckert J. Cadmium toxicity in plants：Is there any analogy to its carcinogenic effect in mammalian cells？ [J]. Biometals， 2005， 18（5）： 475-481.

[13]Lagriffoul A， Mocquot B， Mench M， et al. Cadmium toxicity effects on growth， mineral and activities of stress related enzymes in young maize plants [J]. Plant Soil， 1998，200（2）：241-250.

[14]高芳， 林英杰， 张佳蕾， 等. 镉胁迫对花生生理特性、产量和品质的影响 [J]. 作物学报， 2011， 37（12）： 1-8.

1.2试验设计

盆栽试验在山东省农业科学院试验场防雨棚进行。先将土壤过1 cm孔筛，每盆装土15 kg。氯化镉溶解后，加入土壤并拌匀，土壤Cd浓度为1.0 mg/kg，平衡30 d。每盆施入复合肥30 g，充分混匀。将枯草芽孢杆菌粉末以0、1、2和4 g/kg的施入量掺入到土壤中，每处理20盆。精选大小一致的花生种子种植盆中，每盆3粒。

于苗期、花针期、成熟期，选择受光方向一致的主茎倒3叶取样，一部分样品放入冰盒中用于叶绿素含量和细胞膜透性测定，另一部分迅速放入液氮罐中带回室内，于-40℃低温冰箱中保存，用于保护酶活性测定。同时取根，放入冰盒中用于根系活力测定。于收获期取植株和荚果。

1.3测定项目与方法

1.3.1叶绿素含量测定采用Arnon法[5]，紫外分光光度计测吸光度。

1.3.2叶片细胞膜透性测定取花生叶片0.1 g置于具塞试管中，加入15 ml 1%吐温80，真空泵抽气10 min，缓慢放气。室温振荡60 min，用电导率仪测定其初电导率。再放入沸水浴20 min，冷却后再次测定其终电导率。以相对电导率表示电解质渗出率。

1.3.3根系活力测定TTC还原法[6]测定根系活力。

1.3.4SOD、POD活性和MDA含量测定参照王爱国[7]的方法测定SOD活性；参照愈创木酚法[8]测定POD活性；参照林植芳[9]的方法测定MDA。

1.3.5Cd含量测定采用原子吸收分光光度计法。

1.4数据处理与分析

用DPS7.05统计软件进行方差分析、显著性检验，用Microsoft Excel软件进行图表制作。

2结果与分析

2.1枯草芽孢杆菌对花生生长、产量及Cd积累的影响

2.1.1对花生生长的影响表1表明，适当施用枯草芽孢杆菌可提高花生主茎高、侧枝长和生物量。其中2 g/kg处理效果最显著，其主茎高、侧枝长、植株鲜重和植株干重分别比对照增加了13.54%、18.10%、10.80%和19.35%。

3讨论与结论

Cd污染土壤对植物的影响是多方面的，通过根系的吸收，Cd能改变叶绿体、线粒体等细胞器的结构与功能，从而影响植物的生理代谢活动，给生长发育带来不利影响[11]。此外，Cd可通过食物链等途径直接或间接危害动物和人类的健康[12]。植物叶绿体是较易积累镉的细胞器之一，镉能抑制叶绿素的生物合成[13]。刘文龙等[3]认为不同品种花生叶绿素含量随镉浓度增加而降低的幅度和速度存在明显的差异。高芳等[14]研究显示豫花15叶绿素含量对镉敏感，轻度镉胁迫即可降低其含量。本研究结果表明，枯草芽孢杆菌可以明显缓解轻度Cd胁迫对花生叶绿素含量的影响，施用量越大效果越明显。

Cd浓度在不高于60 mg/L范围内，随着营养液Cd浓度的增大，花生叶绿素含量和根氧化活力极显著降低，根、叶细胞膜透性和丙二醛含量极显著增加[3]。本研究结果表明，枯草芽孢杆菌能明显缓解Cd胁迫对花生叶片相对电导率和根系活力的影响，在花针期效果较明显。花生叶片SOD活性随枯草芽孢杆菌用量增加呈先升高后降低趋势，POD活性呈先降低再升高趋势，MDA含量随枯草芽孢杆菌用量增加而降低。说明适量的枯草芽孢杆菌不仅可以增强抗氧化酶的活性，而且还能减轻膜脂过氧化作用，缓解了Cd对花生的胁迫作用。

镉胁迫降低花生的产量，主要是降低了出仁率和单株荚果数[14]。施用枯草芽孢杆菌可促进花生生长，有效增加花生的主茎高、侧枝长、植株生物量，提高花生产量，2 g/kg处理明显增加了花生的单株果重和饱果率。枯草芽孢杆菌抑制花生籽粒中的Cd积累，其中2 g/kg处理效果最好。我国土壤中镉的卫生标准为1.0 mg/kg（也是本研究设定的依据），即使未达到污染水平，但是生态风险依然存在，在此含量水平下，花生籽粒镉含量为2.0 mg/kg，尽管施用枯草芽孢杆菌使花生籽粒镉积累量降低约25%，但仍超过0.5 mg/kg国家标准（GB15201-1994）的2倍还多，可见镉污染极具隐蔽性，由此带来的花生食品安全风险不容忽视，未来应加强花生镉污染控制技术研究。

参考文献：

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[2]张欣， 范仲学， 郭笃发， 等. 外源物质对农作物镉毒害的缓解效应[J]. 山东农业科学， 2011（1）：68-72.

[3]刘文龙， 王凯荣， 王铭伦. 花生对镉胁迫的生理响应及品种间差异 [J]. 应用生态学报， 2009， 20（2）： 451-459.

[4]高芳. 镉对花生生理特性、产量品质的影响及其钙素调控 [D]. 泰安：山东农业大学， 2011.

[5]Arnon D I. Copper enzymes in isolated chloroplast， polyphenoloxidase in Beta vulgari [J]. Plant Physiol.， 1949（24）：1-5.

[6]李合生. 植物生理生化实验原理和技术 [M]. 北京： 高等教育出版社， 2000：119-120.

[7]王爱国， 罗广华， 邵从本， 等. 大豆种子超氧化物歧化酶的研究 [J]. 植物生理学， 1983， 9（1）： 77-83.

[8]华东师范大学. 植物生理学实验指导 [M]. 北京：人民教育出版社， 1980.

[9]林植芳， 李双顺， 林桂珠， 等. 水稻叶片的衰老与超氧化物歧化酶活性及脂质过氧化作用的关系 [J]. 植物学报， 1984， 26（6）： 605-615.

[10]王凯荣， 张磊. 花生镉污染研究进展[J]. 应用生态学报， 2008， 19（12）： 2757-2762.

[11]Clemens S. Toxic metal accumulation， responses to exposure and mechanisms of tolerance in plants [J]. Biochimie， 2006， 88（11）： 1707-1719.

[12]Deckert J. Cadmium toxicity in plants：Is there any analogy to its carcinogenic effect in mammalian cells？ [J]. Biometals， 2005， 18（5）： 475-481.

[13]Lagriffoul A， Mocquot B， Mench M， et al. Cadmium toxicity effects on growth， mineral and activities of stress related enzymes in young maize plants [J]. Plant Soil， 1998，200（2）：241-250.

[14]高芳， 林英杰， 张佳蕾， 等. 镉胁迫对花生生理特性、产量和品质的影响 [J]. 作物学报， 2011， 37（12）： 1-8.

1.2试验设计

盆栽试验在山东省农业科学院试验场防雨棚进行。先将土壤过1 cm孔筛，每盆装土15 kg。氯化镉溶解后，加入土壤并拌匀，土壤Cd浓度为1.0 mg/kg，平衡30 d。每盆施入复合肥30 g，充分混匀。将枯草芽孢杆菌粉末以0、1、2和4 g/kg的施入量掺入到土壤中，每处理20盆。精选大小一致的花生种子种植盆中，每盆3粒。

于苗期、花针期、成熟期，选择受光方向一致的主茎倒3叶取样，一部分样品放入冰盒中用于叶绿素含量和细胞膜透性测定，另一部分迅速放入液氮罐中带回室内，于-40℃低温冰箱中保存，用于保护酶活性测定。同时取根，放入冰盒中用于根系活力测定。于收获期取植株和荚果。

1.3测定项目与方法

1.3.1叶绿素含量测定采用Arnon法[5]，紫外分光光度计测吸光度。

1.3.2叶片细胞膜透性测定取花生叶片0.1 g置于具塞试管中，加入15 ml 1%吐温80，真空泵抽气10 min，缓慢放气。室温振荡60 min，用电导率仪测定其初电导率。再放入沸水浴20 min，冷却后再次测定其终电导率。以相对电导率表示电解质渗出率。

1.3.3根系活力测定TTC还原法[6]测定根系活力。

1.3.4SOD、POD活性和MDA含量测定参照王爱国[7]的方法测定SOD活性；参照愈创木酚法[8]测定POD活性；参照林植芳[9]的方法测定MDA。

1.3.5Cd含量测定采用原子吸收分光光度计法。

1.4数据处理与分析

用DPS7.05统计软件进行方差分析、显著性检验，用Microsoft Excel软件进行图表制作。

2结果与分析

2.1枯草芽孢杆菌对花生生长、产量及Cd积累的影响

2.1.1对花生生长的影响表1表明，适当施用枯草芽孢杆菌可提高花生主茎高、侧枝长和生物量。其中2 g/kg处理效果最显著，其主茎高、侧枝长、植株鲜重和植株干重分别比对照增加了13.54%、18.10%、10.80%和19.35%。

3讨论与结论

Cd污染土壤对植物的影响是多方面的，通过根系的吸收，Cd能改变叶绿体、线粒体等细胞器的结构与功能，从而影响植物的生理代谢活动，给生长发育带来不利影响[11]。此外，Cd可通过食物链等途径直接或间接危害动物和人类的健康[12]。植物叶绿体是较易积累镉的细胞器之一，镉能抑制叶绿素的生物合成[13]。刘文龙等[3]认为不同品种花生叶绿素含量随镉浓度增加而降低的幅度和速度存在明显的差异。高芳等[14]研究显示豫花15叶绿素含量对镉敏感，轻度镉胁迫即可降低其含量。本研究结果表明，枯草芽孢杆菌可以明显缓解轻度Cd胁迫对花生叶绿素含量的影响，施用量越大效果越明显。

Cd浓度在不高于60 mg/L范围内，随着营养液Cd浓度的增大，花生叶绿素含量和根氧化活力极显著降低，根、叶细胞膜透性和丙二醛含量极显著增加[3]。本研究结果表明，枯草芽孢杆菌能明显缓解Cd胁迫对花生叶片相对电导率和根系活力的影响，在花针期效果较明显。花生叶片SOD活性随枯草芽孢杆菌用量增加呈先升高后降低趋势，POD活性呈先降低再升高趋势，MDA含量随枯草芽孢杆菌用量增加而降低。说明适量的枯草芽孢杆菌不仅可以增强抗氧化酶的活性，而且还能减轻膜脂过氧化作用，缓解了Cd对花生的胁迫作用。

镉胁迫降低花生的产量，主要是降低了出仁率和单株荚果数[14]。施用枯草芽孢杆菌可促进花生生长，有效增加花生的主茎高、侧枝长、植株生物量，提高花生产量，2 g/kg处理明显增加了花生的单株果重和饱果率。枯草芽孢杆菌抑制花生籽粒中的Cd积累，其中2 g/kg处理效果最好。我国土壤中镉的卫生标准为1.0 mg/kg（也是本研究设定的依据），即使未达到污染水平，但是生态风险依然存在，在此含量水平下，花生籽粒镉含量为2.0 mg/kg，尽管施用枯草芽孢杆菌使花生籽粒镉积累量降低约25%，但仍超过0.5 mg/kg国家标准（GB15201-1994）的2倍还多，可见镉污染极具隐蔽性，由此带来的花生食品安全风险不容忽视，未来应加强花生镉污染控制技术研究。

参考文献：

[1]万书波， 单世华，李春娟，等. 我国花生安全生产现状与策略[J]. 花生学报， 2005， 34（1）：1-4.

[2]张欣， 范仲学， 郭笃发， 等. 外源物质对农作物镉毒害的缓解效应[J]. 山东农业科学， 2011（1）：68-72.

[3]刘文龙， 王凯荣， 王铭伦. 花生对镉胁迫的生理响应及品种间差异 [J]. 应用生态学报， 2009， 20（2）： 451-459.

[4]高芳. 镉对花生生理特性、产量品质的影响及其钙素调控 [D]. 泰安：山东农业大学， 2011.

[5]Arnon D I. Copper enzymes in isolated chloroplast， polyphenoloxidase in Beta vulgari [J]. Plant Physiol.， 1949（24）：1-5.

[6]李合生. 植物生理生化实验原理和技术 [M]. 北京： 高等教育出版社， 2000：119-120.

[7]王爱国， 罗广华， 邵从本， 等. 大豆种子超氧化物歧化酶的研究 [J]. 植物生理学， 1983， 9（1）： 77-83.

[8]华东师范大学. 植物生理学实验指导 [M]. 北京：人民教育出版社， 1980.

[9]林植芳， 李双顺， 林桂珠， 等. 水稻叶片的衰老与超氧化物歧化酶活性及脂质过氧化作用的关系 [J]. 植物学报， 1984， 26（6）： 605-615.

[10]王凯荣， 张磊. 花生镉污染研究进展[J]. 应用生态学报， 2008， 19（12）： 2757-2762.

[11]Clemens S. Toxic metal accumulation， responses to exposure and mechanisms of tolerance in plants [J]. Biochimie， 2006， 88（11）： 1707-1719.

[12]Deckert J. Cadmium toxicity in plants：Is there any analogy to its carcinogenic effect in mammalian cells？ [J]. Biometals， 2005， 18（5）： 475-481.

[13]Lagriffoul A， Mocquot B， Mench M， et al. Cadmium toxicity effects on growth， mineral and activities of stress related enzymes in young maize plants [J]. Plant Soil， 1998，200（2）：241-250.

[14]高芳， 林英杰， 张佳蕾， 等. 镉胁迫对花生生理特性、产量和品质的影响 [J]. 作物学报， 2011， 37（12）： 1-8.