黄勋娟，刁宁宁，张建国

(上海理工大学医疗器械与食品学院上海200093)

黑曲霉(Aspergillus niger)是一种常见的曲霉属真菌，广泛分布在谷物、空气、土壤等各种物品上，在生物技术发展过程中发挥了很大的作用，很多产品来自于丝状真菌的初级和次级代谢产物［1］。黑曲霉可用来生产柠檬酸和很多酶类，例如市场上常见淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、葡萄糖酶、葡萄糖苷酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、半乳糖苷酶、木聚糖酶［2］、柚苷酶、单宁酶、脂肪酶、植酸酶［3］、蛋白酶、果胶酶等。还可以根据培养基的不同而产生不同种酶的组合，如纤维素酶、木聚糖酶和果胶酶。根据黑曲霉在产酸性蛋白时对氮源的需要量可分为两大类:一类是需要低C/N，添加无机氮对产酶有利，这一类的有斋藤曲霉(Aspergillus saito)、宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)等;另一类要求较高的C/N，例如泡盛酒曲霉(Aspergillus awamori)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)，这一类酶活性较低。由于美国食品和药物管理局(FDA)已经认定许多来自黑曲霉的产物是安全的［4］，所以黑曲霉被广泛用于食品级产物的生产过程中。黑曲霉不仅被用于生产胞外酶和有机酸类物质，还被用来降解废水中的有机物质，缓解里氏木霉培养过程中纤维二糖的积累而产生的产物反馈抑制。黑曲霉逐渐被改造成模式细胞来生产多种代谢物［5］。由于黑曲霉生产代谢产物与它的菌丝形态有关系，本文对黑曲霉菌丝球的形成机制、菌丝球与产物的关系，以及菌丝的应用等研究进展进行了综述。黑曲霉在液态培养基中可以形成分散的菌丝，也可以形成菌丝球。菌丝球的形成机制是目前研究的热点，而且菌丝球具有沉降速度快、易于固液分离、应用广等优点，逐渐受到研究者的重视。

1 黑曲霉菌丝球的形成机理

丝状真菌在液态培养中有2种完全不同的形态:一种是由菌丝紧密聚集而成菌丝球;另一种是菌丝均匀地分散在培养液中呈细丝状［6］。高橋穰二通过显微镜观察，将丝状真菌的菌丝球形成机制分为2种类型:一类是多个孢子首先聚集、膨胀，再生长出菌丝，由菌丝聚集缠绕形成菌丝球，称为凝聚型(coagulative);另一类由单个孢子首先萌发而生长出菌丝，然后聚集成菌丝球，称为非凝聚型(non-coagulative)。非凝聚型孢子的接种量与菌丝球的个数接近。而凝聚型孢子的接种量与菌丝球的个数呈倍数关系［7］。比较典型的凝聚型丝状真菌有构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉和担子菌白腐菌［8］。非凝聚型丝状真菌有米根霉。LIN等［9］用种群动态描述软件PARSIVAL(Particle size evalution)拟合黑曲霉孢子凝聚的2个阶段后确定了2个步骤的时间节点。孢子在0～8 h内依靠相互碰撞聚集在一起形成孢子聚集体;孢子聚集体在8～16 h内萌发，萌发形成的菌丝利用更多的表面积吸附没有萌发的孢子，导致溶液中孢子颗粒浓度急剧下降。孢子聚集体萌发形成菌丝球的决定性因素是菌丝比生长速率、菌丝表面与颗粒浓度之比。

从微观角度分析，真菌孢子的表面电荷是影响孢子聚集和菌丝球形成的重要因素。孢子之间有3种作用力:范德华力、双电层力和空间力。Krull等［10］通过原子力显微镜观察，以及计算pH和盐浓度对黑曲霉孢子间黏附力的影响表明，黑曲霉孢子的等电点为pH 2左右。pH提高，黑曲霉孢子的绝对电动电势增加。这与高pH下孢子聚集的数量降低的实验结果相一致［11］。Andreas Wargenau 等［12］先在酸性条件下研究了黑曲霉孢子表面电荷的来源。黑曲霉孢子在很宽的pH范围内呈现阴性的迁移率说明黑曲霉孢子在很宽的pH值范围内处于负Zeta电位，这是由于孢子壁上具有较多的弱酸基团(例如羧基)。采用碱液提取孢子壁的黑色素发现，孢子释放的黑色素量与孢子聚集性能成反比。这可能是碱液破坏了孢子壁上的弱酸基团，也可能由于释放黑色素后的孢子壁弱酸基团减少了。由于黑色素分子中含有羧基，所以很可能是由于碱液的作用减少了孢子壁上的黑色素而减少了孢子壁上的羧基［12］。而且黑曲霉孢子凝聚与培养基中的离子有关系［13］，这符合胶体科学中的双电层模型。Wargenau等进一步利用胶体科学中的Poisson-Boltzmann模型分析，发现表面电势与pH呈线性关系［12］。黑色素是黑曲霉孢子细胞壁成分之一，它是高分子质量疏水性色素，可以保护黑曲霉分生孢子［14］。

疏水蛋白也被认为在菌丝球形成过程中发挥重要作用。它是由真菌分泌的分子质量小，含有8个半胱氨酸残基的两亲表面活性蛋白［15］。疏水蛋白在接近亲水-疏水界面时，自动组装成一种两亲水脂膜［16］，在气生菌丝的增长和真菌黏附到固体支撑物过程中有重要作用。Scholtmeijer［17］根据疏水蛋白的溶解性将其分为2类。第1类只能溶解在三氟乙酸和甲酸中;第2类能溶解在乙醇或十二烷基硫酸钠。疏水蛋白在孢子的非特异性吸附中有重要作用［18］。黑曲霉可能产生这两类疏水蛋白［19］，在孢子-表层和孢子-孢子吸引力中扮演了重要的角色，尤其在液态培养中孢子聚集和生物膜形成中有促进作用，但是目前具体机理还不清楚。疏水蛋白有助于孢子之间的凝聚［16］。

孢子聚集后形成菌丝球的阶段受到养分运输、菌丝细胞壁的抗张强度，以及细胞内信号传导菌丝元素的影响［10］。通常情况下，丝状真菌以恒定比生长速率增长，直到底物发生限制。真菌菌丝球的宏观生长通常用颗粒半径描述。通常一个菌丝体的主干菌丝平均长度为100～400 mm，菌丝球的半径为250～2 500 mm。

2 黑曲霉菌丝球形成的影响因素

2.1 营养成分

黑曲霉可以利用多种碳源，在含有葡萄糖的培养基中48h会形成菌丝球［20］，利用甘露醇、葡萄糖和蔗糖时在28～72 h间菌丝球直径增长迅速加快，直至192 h时菌丝球直径开始下降。而黑曲霉在利用可溶性淀粉时生长较慢，菌丝球较小，说明甘露醇、葡萄糖和蔗糖容易被菌丝球利用，所以菌丝球的直径基本呈现匀速增长的状态，生长速度快。Enshay等［21］在搅拌式反应器中以葡萄糖和戊糖作为培养基培养黑曲霉，可以形成直径不超过400 μm的菌丝球。以NH4NO3和NH4Cl做为氮源形成的菌丝球的直径也较大，干湿比变化较稳定。Fe2+可致菌丝球数量较少且大小极不均匀。而Mg2+不仅能促进菌丝球数量增多，且生成的菌丝球大小均匀、表面光滑。Mg2+在孢子聚合过程中能够起到促进作用。而Na+在菌丝球形成的过程中作用较小，这是因为Na+与黑色素的吸附力远小于 Mg2+与黑色素的吸附力［22］。Haq等［23］对金属离子与培养基成分的相互作用的研究表明，在低于2.0×10-5mol/L的Fe2+中添加MgSO4可以降低Fe2+对菌丝生长的促进作用。Mg2+可以使黑曲霉形成松散的菌丝球(直径为0.6 mm)，且有利于柠檬酸的产生。而且添加Mg2+的时机也是一个重要因素。在培养12 h或者18 h后添加Mg2+可以形成较大的菌丝球。添加Cu2+也有类似的效果［23］。另外，增加培养基中磷的含量可以提高菌丝球的直径［24］。

2.2 pH

黑曲霉菌丝球的形成机理表明，pH值是影响孢子凝聚的决定性因素，且认为与孢子具有pH依赖性的表面特性有关系。培养基pH也是影响黑曲霉生成各种蛋白的重要因素［8］。黑曲霉的形态随pH值的改变而有明显变化，在pH 2时比较难形成菌丝球，在pH 3～10之间都可形成菌丝球。pH 3～6之间形成的菌丝球生物量大，球径较均匀，外表光滑、韧性好;pH 7～10的生物量少，菌丝球小，不均匀，韧性差;当培养基初始 pH为4～6时，菌丝球质量较好。不同pH值下，不仅黑曲霉产生的酶的种类不同，酶活力也不同。黑曲霉产生多种有机酸，如柠檬酸、葡萄糖酸、草酸等的量也取决于pH。例如pH＜3.5时有利于TCA循环，从而积累更多的柠檬酸，而在pH 4.5～8时产生葡萄糖酸，pH为6左右可产生果胶酶。

2.3 孢子浓度

孢子碰撞形成晶核的机率受到孢子浓度的影响。菌丝球的直径与孢子浓度呈负相关［24］。黑曲霉形成菌丝球的孢子浓度应小于108/L。当接种量为103/L时，孢子碰撞的机率小，所以有些菌丝球可能未饱和晶核形成。当接种量增大为104/L时形成晶核的机会也相应增大。当接种量高于105/L，每个晶核所含有的孢子数目都达到饱和，所以孢子数量的增加导致晶核数目增加，于是形成菌丝球的数目也增加。接种量过低会使菌种生长缓慢，发酵周期延长，降低发酵效率，而过高的接种量会使菌种生长迅速，不利于产酶。

2.4 搅拌和溶氧

在培养过程中，提高搅拌速率可增加溶氧，但剪切力则会打散黑曲霉菌丝球［8］，一般情况下，将转速控制在100 ～300 r/min。Hesham 等［25］研究表明，不同的搅拌速率下黑曲霉的生长速率不受影响，但是菌丝形态有很大的不同。在低搅拌速率(200 r/min)下形成的黑曲霉菌丝球平均直径为1 500 mm，在搅拌速率为500 r/min时菌丝球直径为400 mm，在800 r/min时菌丝球直径为24 mm。在搅拌速率为200和500 r/min时，菌丝球的颗粒个数分别是(45±5)和(250±40)个/ml。这种菌丝球球径随转速的提高而减小的结论与朱虹的研究结果相一致。但是搅拌速率降低为120 r/min时，菌丝球的形状不规则，由松散的小菌球黏连在一起。这是由于在低转数下菌丝受到的剪切力较小，生成的菌丝球结构松散、外表不光滑，菌丝球之间很容易粘连形成不规则的大颗粒。当搅拌速率升高为160 r/min时，形成的菌丝球各方面性能较好。为了避免搅拌的不足，通过调整通气量来增加体积输入功率之比也可以控制菌丝球的直径和数量［26］，同时能生产大量的淀粉酶。Moreira 等［20］采用一个脉冲流化床生物反应器通过控制反应器的脉冲形成最适剪切力，提高流化质量来控制丝状真菌形成菌丝球，最后形成均匀的菌丝球，并且提高柠檬酸产量。黑曲霉在0.35 S-1的脉冲生物反应器中培养22天后菌丝球直径保持在(3.3±0.1)mm，而在无脉冲生物反应器中培养11 d，菌丝球直径变为(6.7±0.3)mm。

2.5 温度

黑曲霉可以形成菌丝球的温度范围比较广。大多数文献报道的培养温度为27℃或者30℃［27］。培养温度升高(25℃升为30℃)会导致菌丝球的直径变大。当培养温度提高到35℃时，不能形成菌丝球，呈现为无序的菌丝体［28］。

2.6 外源添加物

在培养基中添加表面活性剂可以影响菌丝球的生长。吐温-80使黑曲霉生长的菌丝球松散，直径变大［29］。添加氧载体可提高黑曲霉的生长和代谢，降低菌丝球的直径，提高菌丝球的传质。例如正十二烷在浓度分别为0、2.5%、5%(w/v)时，菌丝球的直径分别为0.75～1.7 μm、0.65 ～1.30 μm 和 0.55 ～2.05 μm［30］。添加硅酸盐、Al2O3等小颗粒可以调节菌丝球直径的大小［31］。

3 黑曲霉菌丝球的应用

3.1 柠檬酸

柠檬酸是世界上产量最大的发酵产品之一。目前市场上99%以上的柠檬酸都是通过黑曲霉发酵法生产的，黑曲霉的形态与产生柠檬酸量有关系。当Mn2+低于14 μg/L时黑曲霉形成菌丝球且产生大量的柠檬酸。当Mn2+高于14 μg/L时黑曲霉成丝状分散在溶液中，产生很少的柠檬酸。虽然通过抑制消减杂交技术(suppression subtractive hybridization)证明有22个基因对Mn2+的作用有响应，但是对于Mn2+对黑曲霉菌丝形态和柠檬酸产量的影响还没有找到明确的分子机制。Gurpreet Singh Dhillon等［32］对苹果渣超滤污泥(APS)液态培养丝状真菌进行了流变剖面的研究，利用黑曲霉NRRL-567在7.5L发酵罐培养发酵产生柠檬酸。发酵液的流变学特性包括菌丝球、控制条件等，证明大量菌丝体使培养液变为非牛顿假塑性流体。但是添加诱导物甲醇后，在非牛顿液态培养基中黑曲霉形成菌丝球。

3.2 污水处理

黑曲霉形成的菌丝球具有厌氧颗粒污泥和好氧颗粒污泥所不具备的很多优点。第1，菌丝球具有较宽泛的成球和生长条件，具有一定的机械强度，能够抵抗较大的水流剪切力，克服颗粒污泥因形成条件难以控制、维护过程复杂而造成的出水水质不稳定现象。第2，菌丝球沉降性能较好，避免了传统活性泥水分离不彻底、系统不够稳定的缺点。第3，菌丝球营养需求简单，生长速度快，没有二次污染，可以实现污泥的资源化，降低污泥处理成本。第4，菌丝球由菌丝缠绕而成，表面有许多空隙，利于传质，其吸附COD、重金属离子及染料的能力远远大于普通活性污泥和颗粒污泥。黑曲霉菌丝球在处理含糖类废水中表现出颗粒透氧性好的特点。虽然颗粒内部处在厌氧条件下，使得部分葡萄糖积累，但绝大部分的菌丝球还是暴露在较高的溶氧中，可以维持较好降解能力。菌丝球的底物渗透率优于聚乙烯醇硼酸［33］。黑曲霉菌丝球应用于含铬废水中还原Cr(VI)可以将99.6%Cr(VI)还原［34］，可以处理豆制品废水56.4%COD［35］和食品工业废水中 90%的淀粉［36］。

3.3 蛋白质生产

黑曲霉可以生产许多种酶，是美国FDA准许使用的食品工业酶的主要生产菌。菌丝球可以降低培养液的黏度，提高吸收底物的速率，所以研究形成菌丝球的方法也是提高黑曲霉产酶性能的一种途径。例如添加聚硅氧烷来促使黑曲霉形成菌丝球提高纤维素水解的酶类［37］。菌丝球产生蛋白质的活性菌丝球是位于菌丝球表层200 μm的部分。目前报道的黑曲霉菌丝球产生的酶有葡萄糖氧化酶、聚半乳糖醛酸苷酶、植酸酶和淀粉酶。

3.4 单细胞的收获

由于黑曲霉菌丝球易于分离的特性，所以被用来收获单细胞微生物。有些微藻是用于生物能源制造热门单细胞微生物。但是微藻类的直径在1～30 μm，由于微藻类细胞小而且分散生长，在技术上难以利用机械过滤等方法收获，收获过程的成本为总成本的20% ～30%。ZHANG等［38］利用丝状真菌和微藻类共同培养，丝状真菌可以使微海藻细胞包裹在菌丝球上，形成有效的将微藻类与溶液分离的菌丝球的，大幅度降低了生产成本，将这种技术用于城市废水处理中，形成的曲霉-微藻类菌丝球直径为 2～5 mm［39］。

3.5 全细胞催化过程

菌丝球还作为一种固定化的全细胞催化剂用于生物转化过程中。例如外消旋的环氧氯丙烷可以被黑曲霉菌丝球转化为S-环氧氯丙烷。而且黑曲霉菌丝可以承受环己烷为溶剂。在这个转化过程中，连续流加环氧氯丙烷也没有表现出对全细胞催化剂抑制现象。最终，得到18.5%的S-环氧氯丙烷［40］。黑曲霉菌丝球作为生物催化剂用于催化没食子酸生成没食子酸丙酯的研究中。在以苯为溶剂中反应18 h后没食子酸丙酯得率达到36.4%［41］。由于黑曲霉可以完成多种特异性的催化反应，所以黑曲霉菌丝球作为催化剂具有广泛的应用前景。例如催化的香叶醇苯氨基甲酸酯孤立双键的不对称双羟基化反应［42］。

4 结语

由于黑曲霉的安全性好，所以被应用于很多领域。黑曲霉在外孢壁上的黑色素和自身分泌的疏水蛋白作用下发生聚集现象，生成菌丝球。黑曲霉菌丝球的形成在很多应用方面起到推动作用，虽然其形成机理尚未完全清楚，但是其形成条件及应用已经很广泛，例如用于有机酸的生产、水处理、单细胞的收获、全细胞催化过程等诸多方面。

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