李长福，梁大敏，束 波，杨加伟，生 欣，范 芳

(遵义医学院 生物化学教研室，贵州 遵义 563099)

在细胞的生存过程中DNA会遭受各种内外源性因素的损伤，使DNA发生单链或双链断裂(double-stranded breaks, DSBs)，如果这些损伤得不到及时修复，可引起细胞基因组不稳定性增加，最终导致细胞死亡，这也是抗癌药物致肿瘤细胞死亡的主要机制[1-2]。非同源重组修复(nonhomologous end-joining，NHEJ)是哺乳动物细胞中最重要的一种修复机制， DNA依赖性蛋白激酶催化亚基(DNA-dependent kinase catalytic subunit，DNA-PKcs)是NHEJ的核心组分，在DSBs修复及癌症预防方面发挥重要作用[3-4]。

为进一步研究DNA-PKcs在NHEJ修复通路及肿瘤细胞DNA损伤修复中的作用，本研究将靶向DNA-PKcs的干扰质粒shDNA-PKcs转染肝癌耐药细胞BEL7402/5-FU，观察DNA-PKcs基因沉默对其下游分子Artemis的激活作用，探讨DNA-PKcs基因影响肝癌细胞Bel7402/5-FU 耐药性的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料 PRNAi-U6.1-Neo shRNA质粒(百奥迈科生物科技有限公司)，BEL7402/5-FU细胞株(南京凯基公司)， LipofectamineTM2000 Reagent(Invitrogen公司)，DNA-PKcs抗体(Assay biotech公司)，Artemis抗体及P-Artemis抗体(abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 用含10%FBS、20 μg/mL 5-FU的1640培养液培养BEL7402/5-FU细胞，置于37 ℃、5%CO2孵箱中培养，细胞贴壁生长，隔天传代。

1.2.2 细胞转染 将培养好的BEL7402/5-FU细胞分为4组：空白对照组、脂质体组、空质粒组和shDNA-PKcs转染组。细胞计数后，将BEL7402/5-FU细胞按8×104细胞/孔接种于6孔培养板中，当细胞生长到70%～80%融合时进行转染，按200 μL/孔将质粒-脂质体复合物加至相应培养孔中，6 h后换液。

1.2.3 实时荧光定量PCR检测DNA-PKcs mRNA水平的表达 按Trizol®Reagent试剂盒说明书提取各组细胞总RNA行real-time PCR扩增，DNA-PKcs及β-actin引物见参考文献[5]。实验组和对照组DNA-PKcs mRNA表达量通过公式2-( △△CT)分析计算。

1.2.4 Western blot检测DNA-PKcs、Artemis及P-Artemis蛋白表达 按常规方法提取各组细胞总蛋白，BCA法计算样品蛋白浓度。……