胥亚楠， 杨 龙,△， 杨天和， 邓春玉， 罗 淋， 覃智芳， 唐 倩， 杨 君

(1贵阳医学院附属人民医院心内科，贵州 贵阳 550002； 2遵义医学院第三附属医院心内科，贵州 遵义 563003； 3广东省人民医院医学研究中心，广东 广州 510080)

心房颤动(房颤)常高发于有高血压、心力衰竭(心衰)等基础疾病的患者[1]。此类基础疾病促使心房容量或压力负荷增加，对心房肌产生牵张刺激，促进心房重构[2]。心房肌细胞离子通道重构是电重构的基础。对房颤离子通道重构的研究涉及多种离子通道的表达和功能改变。瞬时外向钾电流(transient outward potassium current,Ito)和内向整流钾电流(inward rectifier potassium current,IK1)是参与心肌细胞动作电位(action potential, AP)复极相1、3期的主要离子流，其电流大小明显影响AP 1、3相时程。本研究通过体外牵张模型拉伸培养的心房肌细胞，应用膜片钳全细胞记录方法探讨牵张刺激对Ito、IK1及动作电位时程(action potential duration, APD)的影响。

材 料 和 方 法

1 主要试剂

高糖DMEM培养基、胎牛血清和0.25%胰蛋白酶(Gibco),Ⅱ型胶原酶(Invitrogen),辣根过氧化酶抗兔抗体(Santa Cruz),封闭专用脱脂奶粉(普利莱公司),4′, 6-二脒基-2-苯基吲哚(4′, 6-diamidino-2-phenylindole, DAPI； Biobox),硅胶膜购于SMI,5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-bromodeoxyuridine, 5-BrdU)、4-氨基吡啶(4-amion pyridine, 4-AP)、兔抗大鼠α-横纹肌肌动蛋白(a-sarcomeric actin, α-SCA) 抗体和环孢素A(cyclosporine A, CsA)购自于Sigma，其余试剂均为进口分装或国产分析纯。

记录钾电流的细胞外液(mmol/L)：NaCl 136.0、KCl 5.4、MgCl2·6H2O 1.0、NaH2PO40.33、CaCl2·2H2O 2.0、HEPES 10.0和葡萄糖10.0，pH用NaOH调至7.4。记录Ito时，在细胞外液中加入0.3 mmol/L CdCl2和0.5 mmol/L BaCl2分别阻断L-型钙电流(ICa-L)和IK1。记录IK1时，在细胞外液中加入0.5 mmol/L 4-AP和1 μmol/L尼卡地平分别阻断Ito和ICa-L。钾电极内液(mmol/L)：KCl 140、MgCl2·6H2O 1.0、HEPES 10.0、EGTA 5.0、Na2·ATP 5.0，pH用KOH调至7.2。记录动作电位的电极内液(mmol/L)：KCl 140、MgCl2·6H2O 1.0、HEPES 10.0、EGTA 0.05、Na2·ATP 5.0，pH用KOH调至7.2。含钙台氏液(mmol/L)：NaCl 136、KCl 5.4、NaH2PO40.33、葡萄糖10.0、HEPES 10.0和CaCl2·2H2O 2，pH用NaOH调至7.4[3]。

2 动物与仪器

1 日龄SD乳鼠每组9只，由中山大学医学部动物中心提供，雌雄不限，许可证号为[SCXK(粤)2011-0029]。倒置显微镜(ZEISS AXIO型)。电极拉制仪(Narishige PP830型)。膜片钳放大器(Axopatch700B)及附件均为Axon产品。

3 主要方法

3.1乳鼠心房肌细胞分离与培养 分离乳鼠心房并剪碎。以含胰酶与Ⅱ型胶原酶的混合消化液消化6 ～ 7 min，取上层细胞悬液于10% FBS-DMEM中终止消化。重复消化、终止过程，直至组织块完全消化。1 000 r/min离心5 min，弃上清，沉淀加适量完全培养基，制成细胞悬液。采用差速贴壁与BrdU结合，于37 ℃、5% CO2培养箱中纯化培养24 h，更换培养液洗去未贴壁细胞与成纤维细胞，换含5%血清培养基进行下一步实验[4]。

3.2心房肌细胞免疫荧光染色鉴定 细胞爬片培养48 h，4%多聚甲醛室温固定60 min，PBS洗3遍，每次5 min。5% BSA室温封闭30 min后，加Ⅰ抗兔抗大鼠α-SCA抗体(1∶50)4 ℃过夜，PBS洗3遍，每次5 min。加Ⅱ抗羊抗兔IgG-FITC (1∶100)，37 ℃ 60 min。PBS洗3遍，复染细胞核，加入封片剂封片后，于荧光显微镜下观察并摄片[4]。以乳大鼠心脏成纤维细胞作为阴性对照。

3.3细胞牵张刺激 采用静态等双轴牵张装置对心房肌细胞施加定量力学拉伸。牵张刺激可使细胞肥大、蛋白/DNA比值增大。本课题前期实验中，给予培养24 h的心房肌细胞增加12%硅胶膜面积牵张刺激24 h，细胞蛋白质/DNA比值增大，证实了牵张刺激的有效性[5]。

3.4细胞干预分组 细胞培养于牵张装置24 h，更换5% FBS-DMEM培养基。对照组不予牵张刺激；牵张组予以增加12%硅胶膜面积牵张刺激培养24 h。

3.5心房肌细胞Ito和IK1测定 预温0.125%胰酶消化心房肌细胞，制成单细胞悬液。于直径35 mm培养皿中调整细胞数使其密度约为1×102，37 ℃、5% CO2培养2～3 h使细胞贴壁。选择立体感强、大小适中的细胞进行实验。玻璃微电极充灌电极液后电阻为2～4 MΩ。施加负压使电极与细胞表面形成1 GΩ以上高阻抗封接。破膜，给予慢电容补偿，形成全细胞记录。设置钳制电压为-50 mV，给予指令电位-40 mV～+60 mV，步阶电压10 mV，波宽300 ms，频率0.2 Hz的刺激，记录Ito。记录IK1时，将钳制电压设置为-40 mV，指令电压-120 mV～+30 mV，步阶电压10 mV，波宽500 ms，频率0.1 Hz。为避免细胞大小所造成的误差采用电流密度分析，电流密度(pA/pF)=电流强度/电容。电流信号经Ag/AgCl电极引导，由膜片钳AXON 700B放大器放大通过AD/DA转换板，并存储于计算机硬盘中。实验由pCLAMP 10.0软件程序刺激发放和信号采集。

3.6心房肌细胞AP测定 AP记录同膜片钳全细胞记录Ito和IK1相似。区别在于采用细胞贴附技术，形成高阻封接后破膜，不予补偿。并应用全细胞膜片钳技术中的电流钳模式，给予1 nA电流脉冲，波宽5 ms，引发心房肌细胞AP。记录并分析静息膜电位(resting membrane potential, RMP)和动作电位幅度(action potential amplitude, APA)和动作电位复极50%、90%时程(APD50、APD90)。

4 统计学处理

采用pCLAMP 10.0软件进行数据和图形转换，运用SigmaPlot软件绘制离子通道电流密度-电压曲线。用SPSS 13.0统计软件分析。数据以均数±标准差(mean±SD)表示，组间比较采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 乳大鼠心房肌细胞鉴定

由乳鼠心房组织分离、纯化培养48 h的细胞，有95%为 α-SCA抗体免疫荧光染色阳性(图1A)，而成纤维细胞为阴性(图1B)，表明前者为心房肌细胞。

Figure 1. α-SCA antibody immunofluorescence staining of atrial myocytes.A: the left picture is cultured for 48 hours of atrial myocytes of rabbit anti α-SCA antibody immunofluorescence staining, green is positive (×200); the right one is the same vision for nuclear with DAPI (×200)； B: the results of cardiac fibroblasts stained under the same condition of atrial myocytes.

2 牵张对乳大鼠心房肌细胞Ito的影响

2组心房肌细胞Ito在-20 mV激活，电流密度随去极化程度增加而增大，于+60 mV达最大值。与对照组相比，牵张组Ito峰值从+20 mV电压开始显著减小，且牵张组Ito的I-V曲线明显下移，见图2。在+60 mV钳制电压水平，对照组与牵张组电流密度分别为(12.1±2.9)pA/pF 和(1.6±0.4)pA/pF(P<0.01)。

Figure 2. Current density-voltage curve of Ito in neonatal rat atrial myocytes. Mean±SD.n=9. **P<0.01 vs control group.

3 牵张刺激对乳大鼠心房肌细胞IK1的影响

在-90 mV～-120 mV钳制电压水平，牵张组较对照组电流密度明显增大，在-120 mV钳制电压水平，IK1幅度达到最大，此电压下对照组与牵张组平均电流密度分别为(-8.8±0.9)pA/pF和(10.8±0.8)pA/pF(P<0.01)。图3显示IK1的内向整流特性。

4 牵张对乳大鼠心房肌细胞AP的影响

与对照组相比,牵张组心房肌细胞RMP无明显差异，APA降低，APD50和APD90缩短，动作电位形态变窄,见图4、表1。

讨 论

房颤病因繁多，随着基础疾病导致心房压力负荷不断增大，心房肌受到牵张刺激随之增大。压力负荷促使心肌肥大[6]，增加基质金属蛋白酶活性[7]，离子通道相应基因的表达也发生变化，心房发生重构[6,8]。

Ito和IK1分别在AP 1期和3期复极中起着重要作用。房颤患者心房肌细胞Ito密度降低[9]，IK1密度增大[10]，APD缩短，这些改变正是心房重构的电生理特点之一，也可能是促进房颤发生和维持的机制之一[11]。本研究结果显示，牵张组心房肌细胞Ito电流密度从+20 mV开始显著减小，且与对照组相比Ito的I-V曲线明显下移。与王德胜等[9]对房颤患者心房肌细胞研究不同的是，Ito电流密度在+20 mV～+60 mV显著下降，而在较低电压下对照组和牵张组相比电流密度无显著差异。出现上述差异可能因Ito在不同种属表达的差异性。另外，在-120 mV钳制电压水平，牵张刺激促进IK1增大。

Figure 3. Current density-voltage curve of IK1 in neonatal rat atrial myocytes. Mean±SD.n=9. ** P<0.01 vs control group.

Figure 4. Action potential of neonatal rat atrial myocytes.A: a cell of control group; B: a cell of stretched group.

表1 2组动作电位相关参数比较

AP产生的原因主要是由于细胞膜两侧带电离子的不均衡分布，以及在不同情况下细胞膜对一些离子的通透性发生改变所致。因此，AP是由多种离子通道共同参与决定。本研究结果显示牵张组APD50和APD90明显缩短，APA降低，证实牵张刺激促进心房肌细胞电重构。包括心房肌细胞Ito和IK1在内的多种离子通道电流发生改变，导致细胞膜离子通透性变化，影响跨膜离子流，共同导致APD缩短和APA降低。

本研究通过细胞牵张模型，模拟心房负荷过重对心房产生的机械力学作用，反映心房负荷增加对细胞离子通道的影响，为心房电重构和房颤疾病发生机制提供一定的基础研究依据。

[参 考 文 献]

[1] Heeringa J, van der Kuip DA, Hofman A, et al. Prevalence, incidence and lifetime risk of atrial fibrillation: the Rotterdam study[J]. Eur Heart J, 2006, 27(8):949-953.

[2] Kim SJ, Choisy SC, Barman P, et al. Atrial remodeling and the substrate for atrial fibrillation in rat hearts with elevated afterload[J]. Circ Arrhythm Electrophysiol, 2011, 4(5):761-769.

[3] 邓春玉, 唐承静, 邝素娟, 等. 灯盏花素对大鼠心室肌细胞瞬间外向和内向整流钾电流的影响[J]. 中国病理生理杂志, 2008, 24(1):84-88.

[4] 罗 淋, 刘志琴, 杨 龙, 等. 大鼠乳鼠原代心房肌细胞培养的方法及鉴定[J]. 国际心血管病杂志, 2013, 40(2):112-115.

[5] 杨 龙, 何炯红, 袁正强, 等. 替米沙坦抑制钙调神经磷酸酶调控牵张刺激诱导乳鼠心房肌细胞Cav1.2 mRNA的表达[J]. 贵州医药, 2011, 35(9):771-775.

[6] Saygili E, Rana OR, Saygili E, et al. Losartan prevents stretch-induced electrical remodeling in cultured atrial neonatal myocytes[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2007, 292(6):H2898-H2905.

[7] Saygili E, Rana OR, Meyer C, et al. The angiotensin-calcineurin-NFAT pathway mediates stretch-induced up-regulation of matrix metalloproteinases-2/-9 in atrial myocytes[J]. Basic Res Cardiol, 2009, 104(4):435-448.

[8] De Jong AM, Maass AH, Oberdorf-Maass SU, et al. Cyclical stretch induces structural changes in atrial myocytes[J]. J Cell Mol Med, 2013, 17(6):743-753.

[9] 王德胜, 黄从新, 郑 文, 等. 心房颤动心房肌细胞短暂外向钾电流的特点[J]. 中国心脏起搏与心电生理杂志, 2001, 1(52):89-91.

[10] 薛玉梅, 吴书林, 邓春玉, 等. 心房颤动患者内向整流性钾电流及Kir2.1 mRNA表达水平的研究[J]. 中国病理生理杂志, 2005, 21(4):707-710.

[11] Wijffels MC, Kirchhof CJ, Dorland R, et al. Atrial fibrillation begets atrial fibrillation: a study in awake chronically instrumented goats[J]. Circulation, 1995, 92(7):1954-1968.