张 颖，江玲丽

(安徽中医药高等专科学校，安徽芜湖241000)

茯苓为多孔菌科真菌茯苓［Poria cocs(Schw)Wolf］的干燥菌核，具有利水消肿、健脾安神的疗效［1］，其主要成分茯苓多糖和萜类成分还可用于抗肿瘤和调节免疫［2］.中国茯苓资源丰富，全国多地均有出产，但各产区药材质量良莠不齐，甚至出现以次充好的现象［3］.传统观点认为云南茯苓是各产地中质量最好的，而安徽、湖北产量较大［4］.在安徽岳西一带，当地药农认为地产茯苓的质量优于云南茯苓，且在性状方面有与其它各产地不同之处，如色白如玉、气味芬芳［5］.现存文献较多关注于云南茯苓［6］.本研究在前期研究的基础上，扩大了样本的产地范围，比较了包括主要和次要产地的11个产区的茯苓药材中茯苓酸的含量，意在将全国范围内各产地的茯苓药材中主要成分做对比，整体上反应地域气候对茯苓药材的影响，进一步完善茯苓药材的质量标准.

1 材料与仪器

1.1 仪器

美国进口waters E600高效液相色谱仪(waters 2489 UV/Visble Detector，浙江大学N2000色谱工作站)；上海越平仪器厂产FA21048型分析天平；苏州爱拓玛机械公司产ATM40-1B超声波清洗机.

1.2 药材

收集了全国11个产区的茯苓药材，经安徽中医药高等专科学校中药教研室刘学医老师鉴定为多孔菌科真菌茯苓［Poria cocs(Schw)Wolf］的干燥菌核.分别编号如下：A：安徽岳西；B：广西龙胜；C：湖北英山；D：云南榕丰；E：河南周始；F：四川西昌；G：贵州黄平；H：湖南靖州；I：浙江景宁；J：福建永泰；K：江西樟树.

1.3 试剂

乙腈为色谱纯，南京试剂一厂生产；磷酸为色谱纯，天津市光复精细化工研究所生产；水为娃哈哈纯净水；对照品茯苓酸为上海纯优生物科技有限公司提供，批号201301P0734.

2 方法

2.1 色谱条件

waters symmetry C18(5μm，4.6 ×150mm).检测波长为243nm，柱温25℃.流动相为乙腈和0.5%磷酸水溶液混合梯度洗脱［7］，条件如表1所示.采用外标法计算含量，HPLC图谱见图1.

表1 HPLC梯度洗脱条件

图1 HPLC色谱图

2.2 对照品溶液的制备

精密称取茯苓酸对照品适量，用甲醇充分溶解，定容至10ml容量瓶中，摇匀即得浓度为0.13mg/ml的茯苓酸对照品溶液，0.45μm的微孔滤膜过滤待用.

2.3 供试品溶液的制备

将茯苓药材低温干燥后粉碎，过50目筛，精密称取约0.5g，置于100ml具塞锥形瓶中，定量加入甲醇50ml，密塞，称定质量后，超声提取30min，取出冷却后，加甲醇补足损失的重量，静置后取上清液用0.45μm微孔滤膜滤过待用.

2.4 稳定性试验

取茯苓药材(安徽岳西)一份，按2.3方法制得供试品溶液.按2.1项下色谱条件分别在0、2、4、6、12、24h进样分析，得到相应色谱图.记录各色谱图茯苓酸相应峰面积，计算RSD=1.37%，记录各色谱图茯苓酸相应峰相对保留时间，计算RSD=2.3%.表明供试品溶液24h内稳定.

2.5 重现性试验

取同一批茯苓药材(安徽岳西)五份，按2.3方法制得供试品溶液.按2.1项下色谱条件分别进样20μl测定，得到相应色谱图数据.计算各色谱图茯苓酸相应峰面积RSD=0.28%，计算各色谱图茯苓酸相应峰相对保留时间RSD=3.1%.结果表明该方法重现性良好.

2.6 精密度试验

取茯苓药材(安徽岳西)一份，按2.3方法制得供试品溶液.按2.1项下色谱条件连续进样平行测定6次，得到相应色谱图数据.计算各色谱图茯苓酸相应峰面积RSD=0.49%，计算各色谱图茯苓酸相应峰相对保留时间RSD=2.6%.结果表明仪器精密度良好.

2.7 回收率试验

取已知茯苓酸含量的茯苓粉末约0.5g，精密称定6份，加入精密称定的茯苓酸对照品(1.0mg)，测定其回收率，结果见表2.

表2 回收率试验结果(n=6)

2.8 标准曲线与线性考察

精密吸取制备好的标准溶液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0ml，用甲醇溶液定容至 5ml，分别进样 20μl，以对照液质量浓度为横坐标、色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线.得回归方程为Y=9.84X+3.71，相关系数r=0.9997.茯苓酸在0.052～1.04μg范围内，与峰面积呈良好线性关系.

2.9 样品含量测定

将11个产地24批茯苓药材，按2.3项方法制备，取20μl按2.1项色谱条件进样分析，每批平行测试3次，外标法计算茯苓酸含量(%)，结果见表3.

3 讨论

(1)本实验尝试多种色谱条件，在综合文献的基础上，比较了乙腈-水，甲醇-水及乙腈-磷酸水等系统.其中甲醇-水系统导致出峰过于集中，各个色谱峰之间分离度欠佳，不能实现基线分离；乙腈-水系统各色谱峰分离度较好，但峰型较宽，可明显观察到出峰拖尾导致保留时间后移的现象；乙腈-磷酸水在乙腈-水系统的基础上添加少量磷酸，可有效改善峰型拖尾的现象，故选择其为本实验的色谱条件，与文献相吻合.

(2)本实验所考察茯苓产地基本涵盖我国所有茯苓产地.实验数据表明，茯苓酸含量：A：安徽岳西＞D：云南榕丰＞C：湖北英山＞F：四川西昌＞ G：贵州黄平＞B：广西龙胜＞J：福建永泰＞K：江西樟树＞I：浙江景宁＞E：河南周始＞H：湖南靖州，这与传统用药观点及文献报道基本相一致.茯苓的传统道地产区包括两部分，鄂豫皖及云贵地区［8］，实验数据表明这两个地区的茯苓中茯苓酸含量高于其它产区，单从三萜类有效成分茯苓酸含量考虑，这两个区域的茯苓药材质量的确优于其它产区.

表3 含量测定结果(n=3)

(3)比对云南、湖北、安徽三个全国茯苓主产区的茯苓药材茯苓酸含量，安徽岳西所产茯苓略胜于其它两个产地，与当地用药习惯相吻合.但岳西茯苓与其它茯苓之间的性状差别，尚需进一步从化学成分的角度进行分析.

(4)茯苓药材中的茯苓酸含量与地域特点存在一定关联.高海拔略寒冷地区所产茯苓药材含量较高，质量较好，沿海、平原及热带地区所产茯苓药材则含量较低，质量欠佳.这可能与茯苓菌体生长时所需温湿度和气压有关，不同条件下生长程度与分泌物存在一定差别.控制气温与湿度等条件对茯苓的规范化种植具有一定意义.

对不同产地茯苓药材有效成分分析可以从根本上规范茯苓药材的质量评价，为其质量控制提供一定依据和有力的科学保证.

［1］肖崇厚.中药化学［M］.第1版.上海：上海科学技术出版社，1997.

［2］凌一揆，颜正华.中药学［M］.第3版.上海：上海科学技术出版社，1984.

［3］段启，李霞兰，王少军，等.HPLC法测定茯苓皮中茯苓酸［J］.中草药，2006，37(2)：284-285.

［4］任德权.中药指纹图谱质控技术的意义和作用［J］.中药材，2001，24(4)：235-237.

［5］丁岗，王振中，章晨峰，等.茯苓中三铁酸类成分HPLC指纹图谱的初步研究［J］.中国中药杂志，2002，10(10)：27-29.

［6］国家药典委员会.中国药典［M］.第1部.北京：中国医药科技出版社，2010.

［7］张思访，刘静涵，蒋建勤，等.茯苓的化学成分和药理作用及开发［J］.中华实用中西医结合杂志，2005，18(2)：227-230.

［8］郑朝霞.茯苓饮片及其混伪品的鉴别分析［J］.中国中医药现代远程教育，2013(11)：131-133.