王春华， 王苏美， 徐 韬,2， 苏箔金， 黄河澄， 杨惠玲△

(1中山大学中山医学院病理生理学教研室，广东 广州 510080；2中山大学附属佛山医院，广东 佛山 528000； 3中山大学附属汕头医院, 广东 汕头 515031)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是流行于中国以及东南亚地区的一种发生于鼻咽上皮细胞的恶性肿瘤，在广东省尤为高发[1]。目前放疗和顺铂同步放疗是原发鼻咽癌的标准治疗方法[2]，然而经标准治疗后仍有10%～36%鼻咽癌患者出现鼻咽局部复发[3]。由于鼻咽癌复发的机制不清楚，鼻咽癌复发后的再治疗难以取得满意的疗效[4]。之前许多文献都是报道单个的肿瘤标志物与肿瘤的作用，而鼻咽肿瘤的发生、发展是一个多步骤、多阶段的过程，所以本文采用多个肿瘤标记物，希望能更深层次地探索其在肿瘤中的作用。在初发鼻咽癌中，Jab1是一个促瘤因素并已阐释较为清楚[5]，但在复发鼻咽癌中的作用机制仍不清楚。Akt1在初发鼻咽癌中可以稳定MDM2的表达，MDM2作为一种p53的负调控因子能下调p53的表达进而减少细胞凋亡[6]；而Akt1在复发鼻咽癌中机制不清。因而本实验研究用免疫组织化学染色方法和Western blotting方法分别检测鼻咽癌病人组织分子标志物的表达和鼻咽癌细胞在常态和电离辐射(ionizing radiation, IR)后蛋白表达的差异，希望能探明影响鼻咽癌复发的机制，为复发鼻咽癌预测和治疗提供新标志物与靶点。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1细胞 高分化人鼻咽癌 CNE1和低分化鼻咽癌细胞株 CNE-2 来自中山大学肿瘤防治中心；低分化鼻咽癌 HONE1 细胞由美国俄亥俄州立大学 Ronald Glaser 教授提供;正常角质细胞 HOK16B 由 MD 安德森癌症中心 Jeffrey N 教授提供;鼻咽癌辐射抗拒细胞株 CNE-2R[7]为本实验室构建。

1.2取样与病理诊断 筛查和选取中山大学附属佛山医院2003 年至2012 年和中山大学附属汕头医院2001 年至2012 年同一鼻咽癌患者初发与复发癌组织石蜡标本25 对和20 对，并以广州医科大学附属肿瘤医院2006 年至2011 年正常人鼻咽组织石蜡标本40 例为正常对照。病例选取的条件包括：患者放疗前均未行其它治疗，放疗前均有明确的病理学诊断；免疫组化实验之前，HE 染色片请资深病理学教授再行确诊为鼻咽癌，组织学分类明确；有完整的术后随访资料。所有组织标本来源及操作均符合医学伦理标准。

1.3主要试剂 Jab1 鼠单抗购自Abcam；Akt1 兔单抗购自Cell Signaling Technology。小鼠IgG 和兔IgG 即用型SABC 免疫组化染色试剂盒、DAB 显色试剂盒、Ⅰ抗稀释液和苏木素染液均购自武汉博士德生物工程有限公司；Western blotting Ⅱ抗为羊抗兔 IgG-HRP 和羊抗鼠IgG-HRP，均购自Santa Cruz。

2 方法

2.1细胞培养 所有鼻咽癌细胞用含 10% 新生牛血清、青、链霉素的RPMI-1640 细胞培养基；HOK16B细胞多用培养基为角质形成细胞无血清培养基，使用前加入 30 mg/L bovine pituitary extract、0.2 μg/L EGF和5% FBS；细胞均置于 37 ℃、 5% CO2、饱和湿度条件下培养。取对数生长期细胞进行实验。

2.2Western blotting 法检测细胞 Jab1 和 Akt1蛋白的表达 0 Gy 和10 Gy 电离辐射(ionizing radiation,IR)照射细胞，培养 24 h 后收集全细胞蛋白标本，常规 BCA 方法蛋白定量。制备 15% 聚丙烯酰胺凝胶，进行 SDS-PAGE电泳(1.5～2 h)，转移到 PVDF 膜(60 min)，室温 5% BSA 封闭1 h，加Ⅰ抗(Jab1，1∶500；Akt1，1∶1 000；β -actin，1∶10 000)孵育 PVDF 膜 4 ℃过夜，TBST 洗膜 3 次，加Ⅱ抗孵育 60 min，TBST 洗膜 3 次， ECL 发光液显色曝光， ImageJ软件分析结果，以β-actin为内参照。

2.3免疫组化 采用免疫组织化学染色 SABC(spreptavidin-biotin-peroxidase complex)法检测Jab1 和Akt1 在初发、复发鼻咽癌中的表达。实验步骤如下：常规脱蜡水化，3% H2O2处理，滴加封闭液 20 min ，4 ℃条件下与Ⅰ抗(Jab1，1∶150；Akt1，1∶200)孵育过夜，次日滴加羊抗兔/羊抗小鼠 IgG，37 ℃孵育30 min，二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB) 显色，苏木素复染。阴性对照以磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline， PBS)缓冲液代替Ⅰ抗。免疫组化结果判定，高倍镜(×400)下随机选取5 个视野，以胞核/浆黄染的细胞作为阳性表达的细胞，染色强度与阳性细胞百分比得分的乘积为每个视野的分值，5 个视野的平均分值即为最终结果。

3 统计学处理

采用SPSS 13.0 统计软件分析。数据用均数±标准差(mean±SD)表示。4种肿瘤标志物在初发NPC 和正常鼻咽组织表达差异采用卡方检验或Fisher 精确概率法，在复发NPC 和初发NPC 肿瘤标志物表达水平差异采用符号配对秩和检验(Wilcoxon signed-rank test)；以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 复发病人 NPC 组织和初发 NPC 组织Jab1 表达比较

免疫组化检测了45 例病人配对的复发与初发鼻咽癌组织Jab1 蛋白表达发现，阳性颗粒存在于胞核/胞浆中，见图1。如表1所示，复发病人NPC 组织中，Jab1 蛋白细胞核阳性表达率93.02%(40/43)，细胞浆阳性表达率为97.67%(42/43)；初发NPC 组织细胞核阳性表达率为95.45%(42/44)，细胞浆阳性表达率为97.73%(43/44)。结果提示复发NPC 病人Jab1 核表达高于初发NPC 中Jab1 核表达(P<0.05) ， 两者细胞浆之间的Jab1 表达无显著差异。

2 复发病人 NPC 组织和初发 NPC 组织Akt1表达比较

免疫组化检测45 例病人配对的复发与初发鼻咽癌组织Akt1 蛋白表达发现，阳性颗粒存在于胞核和胞浆中，见图2A、B。结果显示(表2)，复发NPC 组织中，Akt1 蛋白细胞核阳性表达率83.72 %(36/43)，细胞浆阳性表达率为93.02 %(40/43)， 初发NPC 细胞核阳性表达率为74.42%(32/43)， 细胞浆阳性表达率为81.40%(35/43)。结果提示复发NPC 病人Akt1的核表达高于初发NPC 中Akt1的核表达 (P=0.01)； 两者细胞浆之间的Akt1 表达无显著差异。

Figure 1. The expression of Jab1 in NPC tissues (×200；×400 in the lower right). A: positive; B: negative.

表1 复发和初发NPC 组织中Jab1 蛋白阳性表达的比较

Figure 2. The expression of Akt1 in NPC tissues(×200；×400 in the lower right). A: positive; B: negative.

3 鼻咽癌细胞中Jab1 和Akt1 蛋白的表达

Western blotting法检测CNE-1、 CNE-2、 CNE-2R 和 HONE1 鼻咽癌细胞以及 HOK16B正常角质细胞中Jab1 和Akt1 的蛋白表达，结果显示(图3)，以正常角质细胞HOK16B 中蛋白表达为基准，辐射抗拒CNE-1、CNE-2R 和HONE1 细胞中的Jab1 蛋白表达均高于辐射敏感CNE-2 细胞中的Jab1蛋白表达(P<0.01)；辐射抗拒CNE-1、CNE-2R 和HONE-1 细胞中的Akt1 蛋白表达均高于CNE-2 细胞中的Akt1 蛋白表达(P<0.01)。 结果提示辐射抗拒鼻咽癌细胞CNE-1、CNE-2R 和HONE1 中Jab1 和Akt1 蛋白表达均高于辐射敏感CNE-2 中Jab1 和Akt1 蛋白表达。

4 IR 对NPC 细胞Jab1 蛋白表达的影响

Western blotting法检测CNE-1、 CNE-2、 CNE-2R 和 HONE1 细胞接受IR照射后Jab1 蛋白的表达，结果显示(图4)，CNE-1、 CNE-2R 和 HONE1 细胞接受10 Gy IR 照射后，Jab1 蛋白表达分别显著高于未接受IR 照射的细胞中Jab1 蛋白表达(均P<0.01)；CNE-2细胞接受10 Gy IR 照射后，Jab1 蛋白表达也显著高于未接受IR 照射的CNE-2 细胞中Jab1 蛋白表达(P<0.01)。结果提示IR促进CNE-1、 CNE-2、 CNE-2R 和 HONE1 细胞中的Jab1 过表达。

讨 论

鼻咽癌是中国南方的高发癌症，放疗为其首选疗法，虽经过改良或与化疗联合应用，仍有20%左右鼻咽癌患者出现鼻咽局部复发，且大部分接受放疗的患者均呈现辐射抗拒，进而加剧了NPC 的复发率。目前鼻咽癌复发机制不明了。故阐明其复发机制对于NPC 的治疗至关重要。为此我们从分子标记物角度着手，欲探讨复发与初发NPC 间差异表达的分子标记物及其与复发的相关机制。

我们通过免疫组织化学方法筛查了配对的复发与初发鼻咽癌组织中Jab1 和Akt1 蛋白的表达差异，发现在复发NPC中Jab1和Akt1核表达均高于初发NPC。为了进一步在细胞水平中验证该结果，我们利用Western blotting法首先检测同源不同辐射抗拒CNE-2R和CNE-2鼻咽癌细胞蛋白的表达差异后发现，Jab1和Akt1蛋白在的CNE-2R细胞中表达均高于其在CNE-2细胞中表达；再次检测不同源不同辐射抗拒的CNE-1、HONE1 细胞与 CNE-2鼻咽癌细胞蛋白表达差异发现，Jab1 和Akt1 蛋白在CNE-1和HONE1细胞中表达均高于其在CNE-2 细胞中表达。本研究结果提示，Jab1 和Akt1 参与NPC 复发。本实验室前期研究亦证实过表达的Jab1 促进鼻咽癌的发生[8]，Wu 等[9]发现过表达Akt1 能促进卵巢癌的发生，Simioni 等[10]发现Akt1 在复发肝癌中的高表达且提示不良预后。我们推测Jab1 和Akt1 表达增高促进鼻咽癌的复发。

表2 复发和初发NPC 组织中Akt1 蛋白阳性表达比较

Figure 3. The protein expression of Jab1 and Akt1 in CNE-1, CNE-2, CNE-2R, HONE1 and HOK16B (normal control) cells.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs CNE-2.

Figure 4. The protein expression of Jab1 in CNE-1, CNE-2, CNE-2R and HONE1 cells 24 h after 10 Gy of ionizing radiation (IR). Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs 0 Gy.

为了进一步探索放疗与Jab1 和Akt1表达水平的关系以及Jab1 和Akt1表达水平与鼻咽癌复发的关系，我们从细胞水平入手，比较IR 照射前后鼻咽癌细胞株CNE-1、HONE1、CNE-2 与 CNE-2R，结果发现上述鼻咽癌细胞IR 照射后细胞中Jab1 的表达均高于IR 照射前的细胞。据文献报道[11]，Akt 能通过磷酸化抑制核内p27 作用，Jab1 能将细胞核p27 带入细胞浆中降解，核内p27 是一个促进细胞凋亡的因素，Jab1 和Akt1 的表达水平及活性能通过调控p27 表达进而影响细胞凋亡。本实验室之前研究表明过表达的Jab1 通过促进p27 核浆转位参与NPC 辐射抗拒，干预Jab1 可逆转NPC 辐射抗拒，也可提高辐射抗拒NPC 细胞对化疗的敏感性；NPC 放化疗抗拒机制可能是通过PI3K-Akt 或Jab1 通路直接作用于p27，调控p27的表达、活性及定位，影响细胞周期和凋亡[12]。由此我们推测IR 照射可促进鼻咽癌细胞Jab1 和Akt1 的过表达，过表达Jab1 和Akt1 通过调控下游靶蛋白介导鼻咽癌细胞辐射抗拒，进而促进鼻咽癌复发，而下游靶蛋白是否为p27 或其它蛋白则有待进一步的实验研究。

综上所述，我们首次发现过表达Jab1 和Akt1 能介导鼻咽癌细胞的辐射抗拒进而促进鼻咽癌的复发。进一步检测Jab1 和Akt1 介导鼻咽癌细胞辐射抗拒的下游信号通路有助于进一步阐明鼻咽癌复发的机制，并有望为复发鼻咽癌治疗提供治疗靶点。

[参 考 文 献]

[1] Yu MC, Yuan JM. Epidemiology of nasopharyngeal carcinoma[J]. Semin Cancer Biol, 2002, 12(6):421-429.

[2] Lee AW, Ng WT, Chan YH, et al. The battle against nasopharyngeal cancer[J]. Radiother Oncol, 2012, 104(3):272-278.

[3] 卢泰祥, 韩 非, 李嘉欣. 复发鼻咽癌临床研究进展[J]. 中国癌症杂志, 2008, 18(9):661-666.

[4] Leung TW, Tung SY, Sze WK, et al. Treatment results of 1070 patients with nasopharyngeal carcinoma: an analysis of survival and failure patterns[J]. Head Neck, 2005, 27(7):555-565.

[5] Pan Y, Zhang Q, Tian L, et al. Jab1/CSN5 negatively regulates p27 and plays a role in the pathogenesis of nasopharyngeal carcinoma[J]. Cancer Res, 2012, 72(7):1890-1900.

[6] Faratian D, Goltsov A, Lebedeva G, et al. Systems biology reveals new strategies for personalizing cancer medicine and confirms the role of PTEN in resistance to trastuzumab[J]. Cancer Res, 2009, 69(16):6713-6720.

[7] 王旭丹, 杨惠玲, 郭禹标, 等. 不同辐射抗拒鼻咽癌细胞微小RNA 差异表达的研究[J]. 中国病理生理杂志, 2007, 23(6):1045-1048．

[8] Pan Y, Zhang Q, Atsaves V, et al. Suppression of Jab1/CSN5 induces radio- and chemo-sensitivity in nasopharyngeal carcinoma through changes to the DNA damage and repair pathways[J]. Oncogene, 2013, 32(22):2756-2766.

[9] Wu H, Cao Y, Weng D, et al. Effect of tumor suppressor gene PTEN on the resistance to cisplatin in human ovarian cancer cell lines and related mechanisms[J]. Cancer Lett, 2008, 271(2):260-271.

[10] Simioni C, Martelli AM, Cani A, et al. The AKT inhibitor MK-2206 is cytotoxic in hepatocarcinoma cells displaying hyperphosphorylated AKT-1 and synergizes with conventional chemotherapy[J].Oncotarget, 2013, 4(9):1496-1506.

[11] Tomoda K, Kubota Y, Kato J. Degradation of the cyclin-dependent-kinase inhibitor p27Kip1is instigated by Jab1[J]. Nature, 1999, 398(6732):160-165.

[12] Qu C, Liang Z, Huang J, et al. MiR-205 determines the radioresistance of human nasopharyngeal carcinoma by directly targeting PTEN[J]. Cell Cycle, 2012, 11(4):785-796.