卢晓旭， 曹 骥， 李 瑗， 孙 雯， 朱伶群， 杨 春， 苏建家

(广西壮族自治区肿瘤防治研究所，广西 南宁 530021)

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC; 以下简称肝癌)是我国最常见的恶性肿瘤之一，其发生发展是一个涉及多因素、多阶段、多基因变异积累的复杂演变过程，如何寻找共识的肝癌关键分子是目前早期诊断和靶向治疗肝癌的基础之一。跨种属筛选肿瘤基因策略[1]指通过探索比较某些肿瘤在不同种属的基因表达谱中共同拥有的基因改变，筛选出该肿瘤发生发展中起关键作用的分子。本研究应用跨种属肿瘤基因筛选策略，结合前期研究[2-3]，通过基因富集及meta分析方法，从5套不同种属的肝癌基因表达芯片中筛选出细胞周期通路中的细胞分裂周基蛋白25a(cell division cycle 25a protein,Cdc25a)等差异表达有统计学意义的基因，通过采用实时荧光定量PCR及Western blotting方法检测其在人、啮齿类动物大鼠和低等灵长类动物树鼩3个种属的肝癌、癌旁及正常肝组织中的表达，以验证前期生物信息学分析的结果，并探讨Cdc25a在肝癌发生发展中的可能作用及意义。

材 料 和 方 法

1 标本收集

1.1人肝组织标本 收集广西医科大学附属肿瘤医院2009年1月～2011年12月手术切除并经病理证实的38例肝癌及对应癌旁组织(距离肿瘤边缘2 cm以外)和10例正常肝组织，正常肝组织来源于肝良性占位病变经手术切除者。肝癌病人术前均无放疗化疗史，患者年龄在24～70岁，中位年龄47.5岁。术后随访1年期间，出现术后复发共20例。

1.2大鼠和树鼩肝组织标本 课题组前期项目已建立用黄曲霉毒素B1诱导肝癌的大鼠及树鼩动物模型。此次实验取大鼠肝癌及其相应癌旁组织各15例、正常肝组织14例，以及树鼩肝癌及其相应癌旁组织10例、正常肝组织10例。所有组织均为手术切除后先经液氮速冻然后转移到-80 ℃；肝癌标本均经病理组织学检查证实。

2 主要试剂与仪器

RNA提取试剂Trizol购自Invitrogen，逆转录试剂盒购自Fermentas，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。PCR产物纯化采用杭州博日公司的Biospin胶回收试剂盒，荧光定量试剂盒为TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司的SYBR® Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time) 试剂盒。Cdc25a Ⅰ抗购自Abcam，GAPDH Ⅰ抗购自北京中杉金桥公司，荧光红外Ⅱ抗购自LI-COR。实时荧光定量PCR仪为ABI生产的ABI StepOneTM，Odyssey红外荧光成像仪为LI-COR产品。

3 方法

3.1实时荧光定量PCR 采用Trizol试剂提取组织总RNA；经微量核酸测定仪检测，A260/A280在1.8～2.0之间为合格；以1.0%琼脂糖电泳和凝胶成像系统检测所提取的总RNA的完整性；取检验合格的RNA，按Fermentas公司逆转录试剂盒说明书进行cDNA合成，产物于-20 ℃保存。根据荧光定量PCR引物设计原则，应用Primer Premier 5.0和DNAMAN软件进行引物设计。Cdc25a上、下游引物序列分别为5′-CCAAAGGAACCATTGAGAAC-3′和5′-CAGATGCCATAATTTCTGGAG-3′，产物长度为138 bp；内参照基因GAPDH上、下游引物序列分别为5′-AAGAAGGTGGTGAAGCAGGC-3′和5′-ACCACCCTGTTGCTGTAGCC-3′， 产物长度为200 bp。

根据试剂盒说明书，采用20 μL反应体系分别以Cdc25a和GAPDH引物进行扩增。反应体系含：SYBR® Premix Ex Taq (2×)10 μL，PCR引物(10 μmol/L)各0.4 μL，ROX reference dye(50×)0.4 μL，灭菌去离子水6.8 μL，cDNA模板2 μL。反应条件为：95 ℃预变性30 s; 95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40个循环。同时，分别构建Cdc25a和GAPDH的标准曲线，并设置标准品的梯度稀释拷贝数。PCR扩增结束后，分析仪即显示标准曲线、扩增曲线和熔解曲线，根据各自标准曲线计算出待测样本中初始mRNA相对表达量。计算各组Cdc25a与对应内参照基因GAPDH相对mRNA表达量的比值，得到肝癌组、癌旁组和正常组3组数据作为Cdc25a mRNA的相对表达量。将PCR扩增产物送北京诺赛基因组研究中心有限公司测序，并将测序结果在NCBI的BLAST中进行比对。

3.2Western blotting检测Cdc25a蛋白 分别取各例组织样本50～100 mg, 常规方法提取总蛋白，加入上样缓冲液煮沸变性，加样进行SDS-PAGE，转膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，洗膜；加Ⅰ抗(Cdc25a工作液浓度 1∶100，GAPDH工作液浓度1∶1 000)，过夜孵育，洗膜；加荧光Ⅱ抗(工作液浓度1∶10 000)，室温避光孵育1 h，洗膜；以Odyssey红外荧光成像仪扫描图像。

4 统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件处理。数据用均数±标准差(mean±SD)表示；多组间均数的比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)；以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 总RNA质量及基因测序

所有样本总RNA的A260/A280比值在1.8～2.0之间，琼脂糖凝胶电泳后成像显示28S、18S和5S条带清晰，提示总RNA质量较好。PCR产物测序结果良好，所得序列经BLAST比对显示各序列的同源性一致，即扩增产物序列与设计序列一致。

2 实时荧光定量PCR反应

Cdc25a和GAPDH的标准曲线决定系数(R2)分别为0.999和0.997，提示直线拟合度良好；斜率(slope)分别为-3.423和-3.614，提示其可在较宽广的范围内进行定量分析。扩增曲线均呈S型，有明显的指数扩增期和平台期，曲线走行光滑，显示扩增结果理想。熔解曲线峰形窄而尖，峰单一无杂峰，说明扩增产物特异性良好，见图1。

Figure 1. Real-time fluorescence quantitative PCR melting curves of Cdc25a and GAPDH.

3 Cdc25a mRNA在人、大鼠和树鼩的肝癌、癌旁和正常肝组织中的表达

实时荧光定量PCR结果显示，人肝癌组织Cdc25a mRNA表达量为0.00425±0.00241，高于其对应的癌旁组织(0.00086±0.00081)及正常肝组织(0.00038±0.00032)，差别均有统计学意义(P<0.05)；癌旁组织与正常组的差别无统计学意义(P>0.05)。Cdc25a mRNA表达量在大鼠肝癌组织为0.00281±0.00278，高于其对应的癌旁组织(0.00044±0.00035)及正常肝组织(0.00051±0.00022)，差别均有统计学意义(P<0.05)；癌旁组织与正常组织的差别无统计学意义(P>0.05)。Cdc25a mRNA表达量在树鼩肝癌组织为0.00043±0.00021，高于正常肝组织(0.00022±0.00010)，差别有统计学意义(P<0.05)；癌旁组织(0.00028±0.00017)与对应的肝癌组织及正常肝组织比较，差别无统计学意义(P>0.05)，见图2。

4 HCC组织中Cdc25a mRNA表达与临床参数的关系

由表1可见，Cdc25a在人肝癌组织中的检出率与临床分期、门静脉癌栓及肝外转移明显相关，而与术后复发、肿瘤直径、肿瘤数目、血清甲胎蛋白水平及肿瘤分化程度无明显关系。

5 Cdc25a蛋白在肝癌组织、癌旁组织和正常肝组织中的表达

在预染色蛋白约36 kD及59 kD处分别可见内参照GAPDH及Cdc25a特异性蛋白条带，但目的蛋白Cdc25a在人正常肝组织、大鼠癌旁及正常肝组织和树鼩癌旁及正常肝组织处未扫描到条带。Cdc25a在人肝癌组织中的平均表达量(0.339±0.239)明显高于其在对应癌旁组织中的平均相对表达量(0.0609±0.0498)，差别有统计学意义(P<0.05)；在人、大鼠和树鼩的肝癌组织中，Cdc25a的条带明显强于癌旁及正常肝组织，与Cdc25a mRNA在肝癌组织的高表达一致，见图3。

Figure 2. The mRNA expression of Cdc25a in the HCC tissues, HCC-adjacent liver tissues and normal liver tissues of humans, rats and tree shrews.Mean±SD.*P<0.05 vs HCC tissues.

Figure 3. Western blotting analysis of Cdc25a protein levels in human (A), rat (B) and tree shew (C) hepatocellular carcinoma tissues. 1, 3: HCC tissues; 2, 4: adjacent liver tissues of HCC; 5, 6: normal liver tissues.

讨 论

几乎所有的癌症都表现为细胞周期的紊乱和不规则，例如调控细胞周期分子的缺失、过表达及突变[4]。细胞周期活性的控制机制主要通过周期蛋白依赖性蛋白激酶(cyclin-dependent kinases, CDKs)、周期蛋白(cyclins)及周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制因子(CDK inhibitors, CKIs)蛋白调控。Cdc25磷酸酶在CDKs去磷酸化激活中起重要作用。Cdc25a作用于cyclin A/CDK2和cyclin E/CDK2，促进细胞从G1期进入S期[5]。Cdc25a作为可活化在细胞周期调控中起核心作用的CDK/cyclin复合体的因子，其过表达可导致细胞周期调控紊乱及对DNA损伤不应答引起细胞异常增殖，甚至肿瘤的发生。

Cdc25a在多种恶性肿瘤[6-8]中呈现高表达，且许多实验证实了其与肿瘤的恶性程度和预后差有关，但是Cdc25a在肝癌组织的表达和临床意义在国内还鲜有报道。2003年Xu等[9]用RT-PCR、免疫组化及Western blotting等方法在mRNA及蛋白水平上检测了肝癌组织中Cdc25a的高表达情况，分别为：69%(9/13)、56%(33/59)及78%(46/59)，并且在免疫组化方法检测时，发现Cdc25a蛋白的高表达与肿瘤低分化、门脉癌栓转移呈正相关。本研究利用荧光定量PCR和Western blotting检测方法发现Cdc25a在人肝癌组织中转录和翻译水平上均呈高表达，与之前Xu等[9]的研究结果相符合。本研究利用Western blotting检测Cdc25a蛋白水平时，发现其在癌旁组织及正常肝组织条带几乎无法辨认，此现象可能与其在应激反应时和正常细胞时相间期被水解有关；Cdc25a正常情况下使cylin E/CDK2和cyclin A/CDK2在起始点激活，促进细胞增殖。Cdc25a蛋白在肝癌组织中高表达，可能与其在肝癌发生发展过程中使癌细胞无限增殖有关[10]。

本研究亦发现Cdc25a在黄曲霉毒素B1诱发的大鼠、树鼩肝癌组织中也呈过表达，一致的表达差异趋势与我们前期已报道的跨种属分析基因芯片数据结果[2]及本实验室之前用cDNA阵列技术研究黄曲霉毒素B1诱发树鼩肝癌形成过程中基因变化发现的结果[11]相符合。跨种属表达验证实验说明Cdc25a在肝癌发生发展中起重要作用。进一步研究Cdc25a mRNA在人肝癌组织中的表达水平与临床参数的关系，发现Cdc25a在人肝癌组织中的表达与临床分期、门静脉癌栓及肝外转移呈正相关，这表明Cdc25a与肝癌患者的病程进展有关，有可能作为评估病情严重程度的参考指标。考虑到样本例数的差异、转录与翻译水平的差异、实验方法的差异等，本研究结果与前面所述Xu等[9]结果不完全相同可能与此有关。

Xu等[12]尝试抑制Cdc25a在肝癌细胞系的活性来阐述其作为抗肿瘤靶点的可能性，结果发现Cdc25a反义寡核苷酸在48 h内导致25%～50%细胞生长被抑制，停滞在G0/G1期，有效抑制了肝癌肿瘤细胞的增殖，再次表明Cdc25a在治疗肿瘤方面是一个可行的靶点。Liu等[13]研究Rock2在信号通路的作用及对肝癌影响时发现，Rock2降低后可激活泛素-蛋白酶体通路，进而促进Cdc25a泛素化，最终使得Cdc25a降解；并且降低Rock2表达可增强DNA损伤时肝癌细胞生长的抑制作用。总之Cdc25a有望成为抗肝癌细胞的治疗新靶点。

本研究结果中Cdc25a在人、大鼠和树鼩3个种属的肝癌组织中mRNA及蛋白表达水平均上调，提示其表达水平的改变可能在肝癌发生发展中起重要作用。同时，本研究结果也证实了跨种属筛选肿瘤相关基因的可行性，为更全面了解肝癌及其它肿瘤的关键基因改变提供一个新的思路。

[参 考 文 献]

[1] 史俊林, 李 瑗. 应用跨种属肿瘤基因筛选策略探寻肿瘤关键分子[J]. 世界华人消化杂志, 2010, 18(12): 1255-1260.

[2] 朱伶群, 曹 骥, 卢晓旭, 等. 跨种属研究Smad3在肝癌组织中的表达及意义[J]. 中国病理生理杂志, 2013,29(1): 70-75.

[3] 曹 骥, 卢晓旭, 胡艳玲, 等. 基因富集及Meta分析对影响肝癌发生发展关键基因的筛选[J]. 世界华人消化杂志, 2012，20(9): 754-758.

[4] 黄文林, 朱孝峰, 信号传导[M]. 第1版. 北京: 人民卫生出版社, 2005: 469.

[5] Krauss G. Biochemistry of signal transduction and regulation[M]. 第3版.北京：化学工业出版社, 2005： 321-324.

[6] Jin Y. 3,3’-Diindolylmethane inhibits breast cancer cell growth via miR-21-mediated Cdc25A degradation[J]. Mol Cell Biochem, 2011， 358(1-2):345-354.

[7] 李金梅, 王 静, 刘 辉, 等. CDC25A、CDC25B在食管鳞癌中的表达及其与凋亡和增殖的关系[J]. 肿瘤, 2008，28(7): 586-590.

[8] Younis RH, Cao W, Lin R, et al. CDC25AQ110del: a novel cell division cycle 25A isoform aberrantly expressed in non-small cell lung cancer [J]. PLoS One, 2012， 7(10):e46464.

[9] Xu X, Yamamoto H, Sakon M, et al. Overexpression of CDC25A phosphatase is associated with hypergrowth activity and poor prognosis of human hepatocellular carcinomas[J]. Clin Cancer Res, 2003， 9(5): 1764-1772.

[10] Kang T, Wei Y, Honaker Y, et al. GSK-3β targets Cdc25A for ubiquitin-mediated proteolysis, and GSK-3β inactivation correlates with Cdc25A overproduction in human cancers[J]. Cancer Cell, 2008，13(1): 36-47.

[11] Li Y, Wan DF, Su JJ, et al. Differential expression of genes during aflatoxin B1-induced hepatocarcinogenesis of tree shrew[J]. World J Gastroenterol，2004, 10(4): 497-504.

[12] Xu X, Yamamoto H, Liu G, et al. CDC25A inhibition suppresses the growth and invasion of human hepatocellular carcinoma cells[J]. Int J Mol Med, 2008， 21(2): 145-152.

[13] Liu T, Yu X, Li G, et al. Rock2 regulates Cdc25A through ubiquitin proteasome system in hepatocellular carcinoma cells[J]. Exp Cell Res, 2012，318(16): 1994-2003.