张庆燕， 赵 慧， 罗 文， 张吉翔

(南昌大学 1第二附属医院消化内科， 2江西省分子医学重点实验室，3医学院， 4第二附属医院门诊部,江西 南昌 330006)

原发性肝癌是一种基因病，唯有追本溯源研究清楚肝癌的发病机制，寻找到有效的候选治疗基因，并研制出综合有效的基因治疗药物，应用到临床治疗中，才能从根本上治疗肝癌。着色性干皮病D组蛋白(xeroderma pigmentosum group D, XPD)是转录因子ⅡH(transcription factor II H，TFⅡH)的一个组分，在真核生物的转录起始和核酸剪切修复(nucleotide excision repair，NER)中起重要作用[1]，大量研究证明，XPD能抑制肝癌细胞的增殖并促进其凋亡，但机制尚不清楚，有待进一步研究。

有丝分裂阻滞缺陷蛋白2(mitotic arrest deficient 2，MAD2)是纺锤体组装检查点(spindle assembly checkpoint，SAC)其中一个关键组分，目前研究表明MAD2的异常表达与肿瘤的发生及预后有关，MAD2的表达受视网膜母细胞瘤蛋白(retinoblastoma, Rb)表达的调控[2]。 本实验将探讨把人pEGFP-N2-XPD重组质粒转染至人HepG2肝癌细胞后,观察XPD对Rb和MAD2表达的影响。

材 料 和 方 法

1 材料

人肝癌HepG2细胞购自美国模式菌种收集中心。重组质粒(带绿色荧光蛋白的XPD重组质粒)由本实验室构建并保存，已通过PCR反应、酶切及基因测序三重鉴定[3]。DMEM培养基和胎牛血清购自HyClone。胰蛋白酶和MTT购自Solarbio。LipofectamineTM2000购自Invitrogen。 TRIzol、2×TaqPCR Master Mix和DMSO购自北京全式金生物技术公司。逆转录试剂盒购自TaKaRa。引物由上海生工生物工程公司合成。Marker I购自北京天根生化科技有限公司。总蛋白提取试剂盒购自北京普利莱基因技术有限公司。XPD单克隆抗体购自Santa Cruz，Rb多克隆兔抗购自Proteintech，MAD2多克隆兔抗购自Anbo，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔Ⅱ抗及山羊抗鼠Ⅱ抗购自北京中杉金桥公司。FACSCalibar流式细胞术为Beckton Dickinson产品。总蛋白提取试剂盒购自北京普利莱基因技术有限公司。

2 方法

2.1细胞培养及转染 HepG2细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养基中，于37 ℃、5%CO2孵箱中培养，以0.25%胰蛋白酶消化，2～3 d传代1次，待细胞培养稳定后进行种皿及转染。实验分为4组：无转染HepG2细胞组(空白对照组)、LipofectamineTM2000转染HepG2细胞组(脂质体组)、空载质粒pEGFP-N2转染细胞组(N2 组)、重组质粒pEGFP-N2-XPD转染细胞组(XPD组)。以2×105cells/well的密度铺于6 cm培养皿内，24 h细胞铺满50%～80%，用LipofectamineTM2000进行瞬时转染， 质粒4.0 μg/well， LipofectamineTM2000 10 μg/well，介导转染。

2.2RT-PCR 检测XPD、Rb及MAD2 mRNA的表达量 转染24 h后TRIzol法提取细胞总RNA，合成cDNA，PCR扩增XPD、Rb及MAD2。根据GenBank上公布的人类XPD、Rb及MAD2 mRNA序列，应用Primer Primier 5软件设计引物，由上海生工生物工程公司合成，见表1。同一标本扩增β-actin作内参照。PCR条件：XPD：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 40 s，72 ℃ 55 s，33个循环；72 ℃ 7 min。Rb：94 ℃ 2 min;94 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 45 s，30个循环；72 ℃ 7 min。MAD2：94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，52 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，30个循环；72 ℃ 10 min。β-actin：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 40 s，72 ℃ 60 s，33个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳(含5 mg/L溴化乙啶)后，在紫外灯下观察结果。通过Quantity One图像分析软件(Bio-Rad)读取目的电泳条带的斑点密度扫描值，以各组β-actin条带的扫描值标化其相应组的XPD、Rb及MAD2的密度扫描值，获得其mRNA相对表达量。实验重复3次。

表1 引物序列和产物大小

2.3Western blotting检测XPD、Rb及MAD2蛋白的表达量 转染48 h后使用蛋白抽提液分别提取4组细胞的总蛋白，全自动生化分析仪(Beckman)测定蛋白浓度。取 40 μg进行SDS-PAGE分离蛋白，蛋白转印到硝酸纤维素膜上，脱脂奶粉溶液 4 ℃封闭过夜。膜分别用按相应比例稀释的XPD、Rb、MAD2和β-actin Ⅰ抗孵育，4 ℃过夜， Ⅱ抗孵育2 h，最后ECL显色，经显影、定影后，观察结果。通过Quantity One图像分析软件(Bio-Rad)读取目的电泳条带的斑点密度扫描值，以各组β-actin条带的扫描值标化其相应组的XPD、Rb及MAD2的密度扫描值，获得其蛋白相对表达量。实验重复3次。

2.4MTT法检测细胞增殖力 上述4组细胞于对数期分别接种于96孔板中，1×103cells/well，以培养基为对照组，于37 ℃、5%CO2的条件下培养24 h后每孔加入5 g/L MTT 10 μL，继续培养4 h，弃上清，加入100 μL DMSO，振荡10 min，酶标仪测定492 nm处各孔吸光度(A)值。实验重复3次。

2.5流式细胞术检测细胞凋亡 4组细胞转染后24 h，用不含EDTA的胰酶消化细胞，然后收集到EP管内，按照凯基细胞凋亡试剂盒说明书依次加入试剂，然后避光孵育，流式细胞术在1 h内上机检测。实验重复3次。

2.6流式细胞术检测细胞周期 4组细胞转染后24 h，用不含EDTA的胰酶消化细胞，然后收集到EP管内，用PBS洗涤细胞1次，制备单细胞悬液离心后，去除上清，加入70%冷乙醇500 μL固定过夜。染色前用PBS洗去固定液，按照凯基周期检测试剂盒说明加入100 μL RNaseA 37 ℃水浴30 min，再加入400 μL碘化丙啶染色混匀，4 ℃避光30 min，应用FACSCalibar流式细胞仪分析细胞周期，得出细胞各周期的百分率。

3 统计学处理

采用SPSS 11.5统计软件分析，符合正态分布的计量资料用均数±标准差(mean±SD)表示，组间比较用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 pEGFP-N2-XPD转染结果

通过脂质体转染方式将pEGFP-N2空载质粒和pEGFP-N2-XPD重组质粒转染入HepG2细胞24 h后，荧光显微镜下可见XPD组和N2组细胞中均有绿色荧光蛋白的表达，绿色荧光覆盖率75%以上，未转染的HepG2细胞则未见表达，见图1。

2 各组细胞内XPD、Rb及MAD2 mRNA的表达

XPD组中XPD和Rb mRNA表达量明显高于其它3组，而MAD2 mRNA表达量低于其它3组，差异均有统计学意义(均P<0.05)，见图2。

Figure 1. The green fluorescent protein expression in HepG2 cells transfected with pEGFP-N2 or pEGFP-N2-XPD under fluorescence microscope (×100).

Figure 2. Relative expression of XPD, Rb and MAD2 mRNA in HepG2 cells detected by RT-PCR. M: marker; 1: blank control group; 2: liposome group; 3: pEGFP-N2 group; 4: pEGFP-N2-XPD group. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs 1.

3 各组细胞XPD 、Rb及MAD2蛋白的表达

XPD组中XPD、Rb蛋白表达量明显高于其它3组，而MAD2蛋白表达量低于其它3组，差异均有统计学意义(均P<0.05)，见图3。

4 pEGFP-N2-XPD重组质粒对HepG2肝癌细胞增殖活力的影响

空白对照组、脂质体组、N2组和XPD组的A值分别为0.624±0.114、0.631±0.144、0.635±0.164和0.300±0.083，XPD组A值明显低于其它3组，差异均有统计学意义(均P<0.05)。

5 细胞凋亡情况

空白对照组、脂质体组、N2组细胞和XPD组细胞凋亡率分别是(5.57±1.58)%、(7.71±1.50)%、(12.70±5.43)%和(33.70±1.39)%，XPD组细胞凋亡明显高于其它3组，差异有统计学意义(均P<0.05)，见图4。

6 细胞周期情况

XPD组的G1期细胞明显高于空白对照组、脂质体组及N2组细胞，S期细胞较其它3组明显减少，差异有统计学意义(均P<0.05)，空白对照组、脂质体组及N2组细胞之间G1期和S期差异无统计学意义(均P>0.05)，见图5。

Figure 3. Relative expression of XPD, Rb and MAD2 proteins in HepG2 cells analysis by Western blotting. 1: blank control group; 2: liposome group; 3: pEGFP-N2 group; 4: pEGFP-N2-XPD group. Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs 1.

Figure 4. Flow cytometric analysis of cell apoptosis. A:blank control group; B:liposome group; C:pEGFP-N2 group; D:pEGFP-N2-XPD group. Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs A.

Figure 5. Flow cytometric analysis of cell cycle. A:blank control group; B: liposome group; C:pEGFP-N2 group; D:pEGFP-N2-XPD group. Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs A.

讨 论

XPD是哺乳动物TFⅡH的一个组分。TFⅡH分为2个基团：核心区(XPB、p52、p62、p44和p34)和CAK(CDK-activating kinase)区(CDK7、cyclin H和MAT1)，其中XPD作为桥梁起连接这2个集团的作用[4]，参与真核生物的转录起始。XPD在真核生物NER中起重要作用[1]，XPD与XPA结合是切除性修复的关键一步，XPD通过XPA的协助结合到DNA损伤部位，然后与XPB解螺旋酶在损伤部位负责打开DNA双链[5-6]。大量研究表明XPD还参与了细胞的增殖、凋亡、肿瘤的发生甚至化疗药物抗药性的产生[7-8]。本实验将XPD重组质粒转染人HepG2肝癌细胞后，发现其会抑制肝癌细胞的增殖，并促进其凋亡。

MAD2是SAC其中一个关键组分，SAC管理姐妹染色体的分配是否准确， MAD2主要感应微管与着丝点的连接[9]。缺少微管附着或附着不稳定的着丝粒会释放抑制后期促发信号，其中MAD2和BubR1(有丝分裂纺锤体组装检测点蛋白)起关键作用，MAD2与细胞分裂周期蛋白20(cell division cycle 20 protein，CDC20)结合，抑制有丝分裂后期促进复合物(anaphase-promoting complex，APC)泛素化，导致分离酶抑制蛋白securin降解受阻，securin会抑制分离酶separase活性使联会蛋白不能降解，从而延迟姐妹染色单体的分离和有丝分裂后期的启动，以争取时间让微管与着丝粒完全稳定地附着，一旦全部染色体的着丝粒和微管稳定附着，着丝粒就停止释放抑制信号，姐妹染色单体同步分离，启动有丝分裂后期。如果检查点中任何一个环节出现异常，姐妹染色单体不能准确分离，就可能导致非整倍体，引起肿瘤的发生。目前研究表明MAD2与肿瘤的发生及预后有关，各种肿瘤细胞中如胃癌、肝癌、淋巴瘤等细胞中MAD2表达明显高于正常细胞，MAD2表达增高会降低肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，与肿瘤的预后不良有关[5]。还有研究表明，MAD2在DNA核酸切除性修复过程中扮演着重要角色，MAD2过表达会抑制XPD在细胞核内积累，并竞争性抑制DNA修复蛋白之间的正常结合，从而负调控DNA核酸切除性修复[5]，但目前暂没有研究表明XPD是否会影响MAD2的表达。本实验将重组质粒pEGFP-N2-XPD转染人肝癌HepG2细胞后，发现XPD过表达能明显抑制MAD2的表达。综合前人的研究表明，XPD 与MAD2之间是可以相互调节的，具体通过何种机制相互调节有待进一步研究。

目前研究表明MAD2的异常表达跟Rb基因发生突变或者缺失有关。Rb基因是人类发现并克隆的第1个抗癌基因[10]，MAD2的表达是通过Rb途径来调节的，正常情况下Rb会抑制E2F转录因子和MAD2的表达，如果Rb基因发生突变或者缺失， E2F和MAD2的表达会增高[2]。当细胞DNA发生损伤时，将启动DNA损伤检查点(G1-S期检查点)，通过各种监测信号，抑制细胞周期蛋白依赖性激酶的激活，从而抑制Rb蛋白的磷酸化，低磷酸化的Rb与转录因子E2F结合，导致E2F失活不能与相关的靶基因结合，抑制了相关蛋白的表达(包括MAD2)，阻滞了细胞周期由G1期向S期转换[11-12]。于是我们设想XPD是否也会影响Rb的表达或者功能的变化。本实验将重组质粒pEGFP-N2-XPD转染人HepG2肝癌细胞后检测Rb表达情况，发现XPD过表达能明显促进Rb的表达。

综上所述，XPD过表达可以抑制MAD2的表达和肝癌细胞的增殖，促进Rb的表达。但是XPD是否是通过Rb途径来抑制MAD2的表达，以及XPD是否会影响Rb蛋白的磷酸化有待进一步的研究。

[参 考 文 献]

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