袁 琳，宁 丹，唐曦阳，李 晶

(中南民族大学 药学院，武汉 430074)

常见的细菌计数方法有比浊法、平板菌落计数法、血球板计数法等.比浊法和血球计数法均能较快的反应细菌数，但不能判断细菌的活性，易受培养基成分和代谢产物性质等的影响[1-3].平板菌落计数法操作复杂、重复性差、耗时长，不适于大批量实验.

MTT 法简单、快速、灵敏、稳定[4]，能准确的反应活细胞相对数目，目前已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验和肿瘤放射敏感性测定等[3, 5-7].MTT 比色法其检测原理为利用活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶将外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)，并沉积在细胞中，而死细胞无此功能，二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，以甲臜生成量与活细胞数量的关系来判断活细胞数量，OD 值越大，细胞活性越强[2,8,9].三羧酸循环中的琥珀酸脱氢酶在真核细胞中主要存在线粒体中，而在原核细胞中主要存在膜间，故MTT 法也可用来检测活细菌数量[10].

金黄色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)是重要的微生物研究材料，也是重要的食品污染指示菌.本实验以金黄色葡萄球菌为对象，探讨MTT 法应用于活细菌细胞数定量分析的可行性和检测条件.

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

金黄色葡萄球菌(ACTT 25923)，由本室保存.胰蛋白胨、酵母提取物、琼脂粉、红霉素、MTT 等(Ameresco,美国).MH肉汤(青岛高科园海博生物技术有限公司)，氯化钠、二甲亚砜、无水乙醇为国产分析纯.

酶标仪(Multiskan ascent，Thermo Electron Corporation)，台式恒温振荡器(THZ-B，江苏太仓市实验设备厂)，洁净工作台(SW-CJ-2FD，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司)，电热恒温培养箱(DH3600B，天津市泰斯特仪器有限公司).

1.2 菌种的活化

将保存在固体培养基上的金黄色葡萄球菌株接种于MH液体培养基中，于37℃，180 r/min过夜培养进行初级活化.将活化好的初级菌种按2.5%的接种量进行二级活化，于37℃，180 r/min继续培养 6～8 h，使其达到对数生长期，用于后续实验.

1.3 吸光度范围的确定

将菌悬液用培养基倍比稀释，于595 nm下直接测定各孔的吸光度，或加入MTT 溶液于37℃作用3 h后以DMSO溶解，于570 nm 波长下测定各孔的吸光度.设6个复孔，重复3次，下同.

1.4 DMSO 用量的对吸光度值的影响

将制备好的菌悬液加入96孔培养板中，MTT溶液作用3h 后，分别加入1～3倍菌液体积的DMSO，于570 nm下检测不同用量DMSO 对吸光度值的影响.分别以培养基、菌悬液、菌悬液+ MTT、菌悬液+不同剂量的DMSO 为对照，于570 nm下测定各孔的吸光度.

1.5 MTT 作用浓度对吸光度值的影响

将制备好的菌悬液加入96 孔培养板中，分别加入浓度为0.05～1.0 mg/mL的MTT 溶液于 37 ℃下恒温培养3 h后加入DMSO 200 μL，于570 nm下测定各孔的吸光度.

1.6 MTT 作用时间对吸光度值的影响

将制备好的菌悬液加入96 孔培养板中，加入MTT 溶液于37 ℃恒温培养0.5～4 h后加入DMSO 200 μL，于570 nm 波长下测定各孔的吸光度.

1.7 MTT吸光度法与平板计数法的相关性

把培养好的金黄色葡萄球菌悬液进行倍比稀释为11个浓度梯度.以0.1 mL/孔均匀涂布接种于96 孔板中，以上述MTT法最适反应条件测各孔吸光度值.同时以0.1 mL/皿均匀涂布于MH固体培养基平板，37 ℃培养24 h，计数各皿菌落数，建立菌液吸光度值与活菌数目的关系曲线.

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 吸光度范围的确定

将培养好的金黄色葡萄球菌悬液接种于96 孔板，进行倍比稀释后，测定OD595，结果见图1a.将与其平行的另一块板加入MTT作用3 h后测定OD值(λ=570 nm，下同)，结果见图1b. 由图1可知，金黄色葡萄球菌悬液吸光度值随着稀释倍数的增加而逐渐下降.以浊度初步估计细菌的数量是可行的，但由于浊度值之间的差异很少，很容易受到其它因素的影响而干扰其结果准确性(图1a).用MTT 法检测细菌数量或活力时，当OD570在0.3～1.7时，随着稀释倍数的增加而呈线性下降趋势(图1b)，在此范围内OD570值与细菌数量呈正比. 为确保各次实验结果的稳定性，实验中所用菌液均调整浊度至OD595值在0.27±0.03范围内.

图1 不同稀释倍数对吸光度值的影响Fig.1 The effect of different dilution ratio on the absorbance value

2.2 DMSO用量对吸光度值的影响

将菌悬液接种于96 孔板中并加入MTT 作用3 h后，加入不同量的DMSO 溶解，测得的吸光度值呈现出一定的变化趋势，结果见图2.如图2所示，随DMSO用量的增加，吸光度值呈上升趋势，当DMSO用量达菌液体积的2～2.5倍时基本达到峰值.考虑到96孔板每孔的容积，故本实验条件下确定DMSO 的最佳剂量为200 μL，即菌液体积的2倍.在此范围内，培养基、菌悬液、菌悬液+MTT、菌悬液+不同剂量的DMSO 所测吸光度值均约为0.2，对MTT法实验基本无影响.故后续实验均以菌悬液+ DMSO为对照.

V/μL图2 不同体积的DMSO 对吸光度值的影响Fig.2 The effect of volumn of DMSO to the absorbance value

2.3 MTT 作用时间对吸光度值的影响

将菌悬液接种于96孔板中，加入MTT 溶液作用0.5～4 h后加入2倍体积的DMSO，于570 nm下测其吸光度.测得的吸光度呈现出一定的变化趋势，结果如图3所示.当作用时间达2 h时吸光度值可达到峰值，故MTT最适作用时间为2 h.

t/h图3 MTT 作用时间对吸光度的影响Fig.3 The effect of MTT reaction time to the absorbance value

2.4 MTT 浓度对吸光度值的影响

将菌悬液接种于96 孔培养板中，加入不同浓度的MTT 溶液，作用2 h 后加入2倍体积的DMSO，其吸光度值呈现典型的“钟型”变化趋势，结果见图4.由图4可见，当MTT作用浓度为0.15～0.25 mg/mL时吸光度值达到峰值.为保证MTT的量足够与菌液中琥珀酸脱氢酶反应，且在MTT 量充足的情况

下尽量降低MTT 毒性，在本实验条件中MTT的最适终浓度为0.25 mg/mL.

ρ/(mg·mL-1)图4 MTT浓度量对吸光度值的影响Fig.4 Effects of the MTT concentration to the absorbance value

2.5 MTT吸光度法与平板菌落计数法的相关性

将MTT法所测的吸光度值与相对应的活菌数目之间建立线性关系曲线，结果如图5所示，活菌数目(菌落数)在一定范围内与菌悬液的MTT吸光度值成线性相关，R2=0.9966,y=1008.9x-22.327.

D(λ) 图5 吸光度值与平板菌落数目的关系Fig.5 The relationship between the absorbance value and the tablet colony numbers

3 讨论

MTT能被活细胞线粒体中脱氢酶还原成蓝细胞活性状态色Formazan 颗粒，颗粒形成量与活细胞数量成正比.细菌个体很小，通常在培养基中呈混悬状生长，低速离心很难将其从培养基中完全分离.而Formazan颗粒需要有机溶剂溶解，这可能是MTT法在细菌中很少使用的原因之一.

本文首先探讨了在不去除上清的情况下，DMSO 对金黄色葡萄球菌细菌中Formazan颗粒的溶解情况，当DMSO用量低于2倍菌液体积时，Formazan颗粒不能完全溶解，吸光度值随DMSO用量的增加而升高；而当DMSO用量高于2.5倍菌液体积时，吸光度值则不再升高，说明Formazan颗粒

已完全溶解.因此，2～2.5倍菌液体积的DMSO为最适的溶解Formazan颗粒的实验条件.当MTT作用时间达到并超过2 h后，其吸光度值即可达到峰值，这与细胞需要作用3～4 h不同，可能与两者脱氢酶存在的部位不同及代谢活性有关.

MTT对活的细菌具有毒性，当MTT的终浓度小于0.15 mg/mL时，随着MTT用量的增加吸光度值不断增大；在0.15～0.25 mg/mL时，吸光度值维持在较高水平；但MTT浓度继续增大则吸光度值呈持续下降，说明高浓度的MTT导致细菌活力下降甚至死亡.这可能是因为大量形成的Formazan颗粒结晶对细菌形成机械损伤甚至破裂死亡.以有足量甚至过量的MTT与菌液中琥珀酸脱氢酶反应，本实验确定最适MTT浓度为0.25 mg/mL.

当细菌数在105～107个/mL时，MTT法所测的吸光度值与平板法所测的细菌活菌数量呈线性相关，R2>0.99，说明MTT法在一定范围内可准确反映活菌数量.

参 考 文 献

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