邹金艳 商建 易三凤 伍威 林军

Wnt/β-catenin信号通路直接影响胰腺癌细胞的增殖、分化和迁移。研究发现，在许多肿瘤组织中Wnt/β-catenin信号通路异常激活[1-4]。β-catenin在胰腺上皮内瘤变(pancreatic intraepithelial neoplasia, PanIN)及胰腺癌蛋白的核内高度积聚[5]。文献报道[6]，非甾体抗炎药(non-steroidal anti-inflammatory drugs, NASIDs)能抑制结肠癌组织中Wnt/β-catenin信号通路，抑制β-catenin的核聚集及β-catenin/TCF靶基因的转录。但NASIDs对胰腺癌的作用目前少有研究。本研究应用NASIDs的舒林酸处理人胰腺癌细胞PANC1，观察其对PANC1细胞增殖、凋亡及Wnt信号通路成员β-catenin表达的影响。

一、材料和方法

1．细胞增殖测定：人胰腺癌细胞PANC1购于中国科学院典型培养物委员会细胞库(上海)，常规培养、传代。取对数生长期细胞接种于96孔板，应用0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L的舒林酸(美国Enzo公司)分别处理PANC1细胞24、48、72 h，以不加舒林酸的细胞作为对照组。应用MTT法检测细胞的增殖，按MTT试剂盒(江苏碧云天生物科技有限公司)说明书操作。最后上酶标仪测各孔在波长490 nm处的吸光度值(A490值)。生长抑制率=实验组A490值/对照组A490值×100%。

2．细胞凋亡测定：取不同浓度舒林酸处理48 h的PANC1细胞，常规消化制备细胞悬液，按照Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒说明书操作。染色完成后1 h内上流式细胞仪检测。

3．β-catenin mRNA表达检测：利用Primer Express1.5软件设计β-catenin引物，序列为5′-GTGCTATCTGTCTGCTCTAGTA-3′及5′-CTTCCTGTTTAGTTGCAGCATC-3′；内参GAPDH引物序列为5′-GAAGGTGAAGGTCGGAAGT-3′及5′-GGAAGATGGTGATGGGATT-3′。 引物由上海生工合成。取不同浓度舒林酸处理24 h的PANC1细胞以及2 mmol/L舒林酸处理12、24、48、72 h的PANC1细胞，采用Trizol(美国Invitrogen公司)提取细胞总RNA，采用RT-PCR法检测β-catenin mRNA表达。先逆转录成cDNA。PCR条件：94℃ 5 min，94℃ 45 s、58℃ 30 s、72℃ 45 s，35个循环，最后72℃ 10 min。PCR产物在1%琼脂糖凝胶电泳分离后扫描，以目的条带与内参条带灰度比值表示mRNA表达量。

4．β-catenin蛋白表达检测：取不同浓度舒林酸处理24、48 h的PANC1细胞，制作细胞爬片，采用免疫组化SP法检测β-catenin蛋白。……