常童洁 曹 媛 张文超 荆艳萍

(北京林业大学，北京，100083) (中国林业科学研究院) (北京林业大学)

毛白杨花粉败育过程中淀粉和脂类的异常分布变化1)

常童洁 曹 媛 张文超 荆艳萍

(北京林业大学，北京，100083) (中国林业科学研究院) (北京林业大学)

对毛白杨雄性可育无性系1 319以及不育雄株BM-1花药发育过程中营养物质的分布和转化过程进行观察，结果表明：可育花药中，淀粉粒出现于小孢子母细胞时期的花药壁及小孢子母细胞内；到四分体时期，四分体外围、绒毡层内表皮以及花药表皮和内壁间开始积累脂类，药壁内淀粉含量减少；初生小孢子时期，绒毡层细胞开始退化，绒毡层细胞以及初生小孢子外壁积累大量脂类物质；成熟花粉时期，绒毡层完全降解，但绒毡层细胞残迹内仍有大量脂类物质积累，花粉表面完全被脂类包围，花粉内含少量淀粉粒。与可育花药相比，不育花药中药壁组织以及药室内脂类物质的合成量很少，花粉大多干瘪异常，无明显的脂类物质分布。上述结果说明脂类物质的匮乏以及营养物质的代谢紊乱是毛白杨花粉败育的原因之一。

毛白杨；花粉；败育；淀粉；脂类

We investigated the distributions of polysaccharides and lipids during the anther development ofPopulustomentosaCarr. male fertile clone 1319 and sterile stub BM-1. In fertile anthers, only polysaccharides depositions are at the microspore mother cells and anther wall. At the tetrad stage, lipids begins to accumulate around the tetrad on the endoscopic wall of tapetum cells and between the endothecium and epidermis. And then the tapetum begins to degenerate, and there are many lipids in degenerating tapetal cells and the microspore periphery. At the mature pollen stage, the tapetum degenerates completely and the tapetal residue becomes massy lipids. There are a few polysaccharides in pollen and lots of lipids accumulated in pollen surface. Compared with its counterpart, there is no obvious lipids synthesis during the whole anther development process of BM-1. Therefore, the abnormal synthesis and distribution of polysaccharides and lipids is one of the reasons for pollen abortion ofP.tomentosaCarr.

高等植物有性生殖的前提是能够产生正常可育的花粉。花粉的发育是一个复杂的过程，它伴随着营养物质如多糖、脂类等的合成与分泌，而这些物质又为之后花粉的萌发提供营养[1]。花粉发育过程中营养物质的积累具有一定的时空特异性，通常在小孢子分裂后的二胞花粉中才开始大量积累[2]。此外，绒毡层细胞也在各个阶段合成并分泌不同的营养物质，为花粉的发育提供营养[3-5]。不同植物花粉和花药发育过程中营养物质积累的时期和特征存在差异[6-8]。研究发现，花粉内营养物质的异常分布以及绒毡层营养物质的异常积累均可以导致花粉的败育[6，9-10]。例如，在不育小白菜(BrassicaCampestrisL. ssp.ChinensisMakino)成熟花粉内仅含少量营养物质，绒毡层内无脂类物质积累[6]；败育的无仔柑橘(C.suavissima)突变体花粉中营养物分布异常，绒毡层内无营养物的积累[11]。

毛白杨(PopulustomentosaCarr)属雌雄异株，雄株花粉败育严重，部分甚至没有花粉。已有的研究表明，毛白杨花粉败育与染色体的异常行为、胼胝质的异常分布等有关[12-13]。但有关毛白杨花粉发育过程中营养物质的积累规律尚未见报道。本研究通过观察毛白杨花粉败育过程中不同发育阶段花药中淀粉和脂类的分布和转化，并与正常发育的花粉进行比较，旨在发现毛白杨花粉发育过程中淀粉和脂类物质积累的时空规律，探究淀粉和脂类营养物质的分布和转化与毛白杨花粉败育之间的关系，从而为丰富毛白杨花粉败育机理提供有力的依据。

1 材料与方法

毛白杨不育雄株BM-1采自北京林业大学校内，育性良好的毛白杨无性系1319采自河北省邢台市威县国家杨树良种基地。采集花枝后按照Wang等[14]方法温室水培，取不同发育阶段的两种花药进行试验。每个阶段取5～10个花序，每个花序取中部50～100个花药进行重复试验。

取不同发育阶段的新鲜花药，放入卡诺固定液(V(无水乙醇)∶V(冰醋酸)=3∶1)中进行固定，抽真空30 min，继续室温下固定1 h，梯度酒精脱水后石蜡包埋。切片、脱蜡、复水后用苏木精染色5～10 min。50%甘油封片，光学显微镜下观察花药不同发育阶段的结构特征。

取不同发育阶段的新鲜花药，扎孔后在3%的戊二醛(pH=7.8)中室温下前固定24 h。用0.1 mol/L KH2PO4缓冲液洗涤3次后，于1%的OsO4缓冲液中4 ℃ 进行后固定10 h。双蒸水洗涤3次后，乙醇梯度脱水，每个梯度30 min。在丙酮溶液中固定1 h后转入丙酮与树脂混合液中，Spurr树脂包埋。用Leica Ultracut R 型超薄切片机制作半薄切片，切片厚度为1 μm。参照胡适宜等[15]的方法，用高碘酸-希夫反应和苏丹黑B 复染，分别标记细胞内多糖物质和脂类物质。用Leica DMR 显微镜观察、拍照。

2 结果与分析

2.1 花药发育过程的细胞学观察

通过石蜡切片后苏木精染色分别观察育性良好毛白杨和不育毛白杨雄株的花药，成熟的花药壁从外向内共分4部分组成：表皮、药室内壁、中层、绒毡层。在花粉发育过程中，花粉母细胞经两轮细胞分裂，形成单倍体的小孢子。在花粉母细胞(图1A,E)和四分体时期(图1B, F)，可育和不育花药细胞形态学未发现明显的区别。初生小孢子时期，育性良好的花药绒毡层细胞排列疏松，开始解体(图1C)；而不育花药绒毡层细胞排列依然比较紧密(图1G)。在成熟花粉时期，育性良好的花粉饱满，花药绒毡层基本完全解体(图1D)；不育花粉干瘪畸形，绒毡层排列混乱，解体不完全(图1H)。

2.2 花药发育过程中淀粉和脂类的分布

小孢子母细胞时期，毛白杨可育无性系1319的花药表皮、内壁、中层细胞、绒毡层、小孢子母细胞细胞质内均有大量淀粉粒分布，无脂类物质分布(图2A)。经过两次减数分裂进入四分体时期，此时在花药壁上的淀粉粒减少，绒毡层内有大量淀粉粒分布，在花药表皮与内壁细胞间和绒毡层的内表面有少量脂类物质分布，四分体外围也开始有脂类物质积累(图2B)。在初生小孢子时期，花药外壁、内壁及中层上仍有脂类分布，淀粉粒分布很少，此时的绒毡层内淀粉粒也减少，但脂类物质继续积累，在初生小孢子外壁分布有大量脂类物质，内含少量淀粉粒(图2C)。当花粉发育成熟时，在绒毡层细胞残迹内含大量脂类物质，无淀粉分布，花粉内部含淀粉，花粉外壁完全形成，显示黑色，表明其含大量脂类物质(图2D)。

在毛白杨不育雄株BM-1花药发育过程中，营养物的分布和转换没有发生明显改变。在小孢子母细胞时期不育雄株BM-1与可育无性系1319花药内营养物分布类似，在花药壁和小孢子母细胞内均有淀粉粒的分布，但含量较少，也没有脂类物质积累(图2E)。四分体时期的花药壁和绒毡层细胞均沉积有淀粉，而无明显脂类物质的积累。四分体和初生小孢子时期，大部分四分体和小孢子畸形干瘪，其外壁和绒毡层内均无明显脂类物质积累(图2F, G)。与毛白杨1319相比，BM-1成熟花粉时期，绒毡层残迹内仍含大量淀粉，无明显的脂类分布，在花药外壁，内壁及中层细胞内也无脂类的分布。花粉内含少量淀粉，花粉外壁上脂类物质分布不明显，大部分花粉干瘪败育，仅少量花粉饱满(图2H)。

A.毛白杨无性系1319花粉母细胞时期；B.毛白杨无性系1319四分体时期; C.毛白杨无性系1319初生小孢子时期(绒毡层开始解体);D.毛白杨无性系1319花粉成熟期(花粉饱满，绒毡层基本完全解体);E.毛白杨不育雄株BM-1花粉母细胞时期;F.毛白杨不育雄株BM-1四分体时期;G.毛白杨不育雄株BM-1初生小孢子时期(绒毡层排列紧密，无明显解体);H.毛白杨不育雄株BM-1花粉成熟期(大部分花粉干瘪畸形，绒毡层未完全解体);标尺=50 μm。

图1 毛白杨无性系1319和不育雄株BM-1不同发育时期的花药

3 结论与讨论

花药正常发育的一个重要环节是大分子营养物质的正常运输和转化[16]。不同植物营养物质运输及转化呈多样性。厚萼凌霄(Campsisradicans)花药发育过程中，淀粉在产孢细胞阶段的花药壁大量积累，并随着花药的发育逐渐减少，在绒毡层降解后消失。脂类则在四分体阶段的绒毡层开始积累，之后在液泡化的小孢子阶段消失。厚萼凌霄四分体和二胞花粉均有一定数量的淀粉和脂类积累[17]。胡萝卜(Daucuscarota)四分体时期的花药内壁和绒毡层内只有淀粉分布，随着花粉的发育，花药内壁及绒毡层内淀粉粒消失，花粉内出现淀粉的积累，当绒毡层开始退化时，绒毡层细胞内及花粉内都有脂类物质积累，其成熟花粉内储存物主要为脂类物质，同时也有少量淀粉存在[18]。厚萼凌霄和胡萝卜都呈现出绒毡层细胞将淀粉物质转化为脂类供花粉吸收的特点。然而，在芒果(Mangiferaindica)花药发育过程中，药壁组织中淀粉以及脂类物质一直较少，其成熟花粉中主要含有淀粉粒，而脂类物质也很少[19]。鹅掌楸(Liriodendronchinensis)小孢子发育时期，脂类物质多集中在小孢子的壁上，绒毡层细胞中脂滴大多分布在绒毡层细胞的内切向面和径切面向上[20]。

A.小孢子母细胞时期，花药药壁内及小孢子母细胞的细胞质含大量淀粉；B.四分体时期，四分体外围和绒毡层内表皮开始有脂类积累，药壁内淀粉含量减少；C.初生小孢子外壁及绒毡层已积累大量脂类；D.花粉成熟期，花粉外壁完全被脂类物质包围，绒毡层残迹细胞内含大量脂类。E.小孢子母细胞时期，花药壁及小孢子母细胞内均有淀粉粒的分布，无脂类物质积累；F.四分体时期，四分体内淀粉含量减少，无脂类积累，花药壁中分布少量淀粉；G.初生小孢子时期，小孢子外壁及绒毡层上无明显脂类积累，内含少量淀粉；H.成熟花粉时期，大部分花粉干瘪败育，胞内含少量淀粉，花粉外壁无明显脂类积累，此时的绒毡层内仍含有淀粉，而无明显脂类物质。MMC.小孢子母细胞;EP.表皮;EN.内壁;ML.中层细胞;T.绒毡层。标尺=25 μm。

图2 毛白杨无性系1319和不育雄株BM-1花药发育过程中多糖和脂类物质的分布

本研究在毛白杨中发现其花药发育过程中首先在花药壁组织以及小孢子母细胞中出现淀粉的积累(图2A)，随后多糖物质向脂类物质转化，在花药壁层细胞间隙、绒毡层细胞以及不同阶段的小孢子壁出现脂类物质积累，随着花粉的成熟，绒毡层细胞完全降解，其脂类物质被花粉所吸收，成熟花粉壁储存了大量脂类物质，花粉内亦含少量淀粉粒。脂类物质集中在小孢子和花粉壁上的结果与鹅掌楸中的结果相似，研究表明，花粉外壁上大量脂类物质的积累可能与阻挡紫外线的辐射相关[21]。

花药发育过程中，绒毡层细胞发生了复杂的变化，它为花粉的发育提供所需的蛋白质、脂质、多糖以及所需的大分子物质[5]。最终绒毡层残留物参与到花粉壁的合成，为花粉外壁提供材料[22]。已有的研究表明，绒毡层内营养物转化及分布异常可导致花粉败育[10]。不育白菜花药发育过程中，其花粉外壁和绒毡层无明显脂类积累，其因营养物分布异常而导致不育[6]。本研究中，毛白杨不育雄株BM-1花药药壁及小孢子母细胞内只有淀粉粒分布，直到成熟花粉时期，其花粉外壁和绒毡层内都含有淀粉粒，而无明显的脂类物质分布。BM-1花药绒毡层细胞脂类物质的缺乏，表明其淀粉类物质转化成脂质、脂质营养物的合成等过程发生了紊乱。张文超等发现毛白杨雄株BM-1绒毡层细胞发生了非正常程序性死亡[13]，可能与绒毡层细胞的代谢紊乱相关。综上分析，毛白杨不育雄株BM-1花药发育过程中，花药壁以及不同时期的小孢子中脂类营养物质明显匮乏，其绒毡层细胞脂类物质的匮乏以及代谢的紊乱均可以引发绒毡层非正常程序性死亡，无法为花粉适时提供营养物质，从而导致花粉壁脂类物质的缺乏，最终花粉发育不完全而败育。

[1] Liu Rushi, Qiu Yilan, Wei Dongmei, et al. Distribution of starch and neutral lipids in the developing anthers ofLpomoeacairica[J]. Annales Botanici Fennici,2011,48(3):256-262.

[2] Calzoni G L, Speranza A, Caramiello R, et al. Wall ultrastructure and biochemical features of theJuglansregiaL. andJuglansnigraL male gametophyte[J]. Sexual Plant Reproduction,1990,3(2):139-146.

[3] Harder L D, Johnson S D. Function and evolution of aggregated pollen in angiosperms[J]. International Journal of Plant Sciences,2008,169(1):59-78.

[4] Chen Bingxiao, Zhao Chunhai, Zhao Yunyun, et al. Pollen morphology and ontogeny ofMaianthemumbifolium(L.)[J]. Plant Systematics and Evolution,2013,299(1):123-129.

[5] Zhu Jun, Lou Yue, Xu Xiaofeng, et al. A genetic pathway for tapetum development and function inArabidopsis[J]. Journal of Integrative Plant Biology,2011,53(11):892-900.

[6] Xie Chaotian, Yang Yanhong, Qiu Yilan, et al. Cytochemical investigation of genic male-sterility in Chinese cabbage[J]. Sexual Plant Reproduction,2005,18(2):75-80.

[7] 包晗,宋玉燕,马燕,等.水鬼蕉花药发育中多糖和脂滴组织化学研究[J].植物生理学报,2011,47(6):565-569.

[8] Konyar S T, Dane F. Cytochemistry of pollen development inCampsisradicans(L) seem (Bignoniaceae)[J]. Plant Systematics and Evolution,2013,299(1):87-95.

[9] Rhee S Y, Osborne E, Poindexter P D, et al. Microspore separation in the quartet 3 mutants ofarabidopsisis impaired by a defect in a developmentally regulated polygalacturonase required for pollen mother cell wall degradation[J]. Plant Physiology,2003,133(3):1170-1180.

[10] Xu Qing, Qin Ken, Zhang Yan, et al. The relation between anther’s nutrient metabolism and pollen abortion of male sterile lines inLyciumbarbarumL[J]. Agricultural Science and Technology,2009,10(5):147-150,170.

[11] Hu Zhiyong, Zhang Min, Wen Jie, et al. Abnormal microspore development leads to pollen abortion in a seedless mutant of ‘Ougan’ mandarin[J]. Journal of the American Society for Horticultural Science,2007,132(6):777-782.

[12] 张志毅,黄智慧,张东方,等.毛白杨标本园无性系开花结实的研究[J].北京林业大学学报,1992,14(增刊3):43-51.

[13] 张文超，曹媛，常童洁，等.毛白杨花粉败育过程中胼胝质的异常分布变化[J].东北林业大学学报,2013,41(1):68-71.

[14] Wang Jun, Kang Xiangyang, Zhu Qi. Variation in pollen formation and its cytological mechanism in an allotriploid white poplar[J]. Tree Genetics & Genomes,2010,6(2):281-290.

[15] 胡适宜,徐丽云.显示环氧树脂厚切片中多糖、蛋白质和脂类的细胞化学方法[J].植物学报,1990,32(11):841-846.

[16] Xie Chaotian, Yang Yanhong, Zhu Xueyi, et al. Cytochemical observation of anthers of Chinese cabbages male sterileline[J]. J Mol Cell Biol，2004,37(4):295-302.

[17] Konyar S T, Dane F, Tütüncü S. Distribution of insoluble polysaccharides, neutral lipids, and proteins in the developing anthers ofCampsisradicans(L.) seem. (Bignoniaceae)[J]. Plant Systematics and Evolution,2013,299(4):743-760.

[18] 吴晓琛,于金金,田惠桥.胡萝卜花药发育的组织化学研究[J].亚热带植物科学,2012,41(4):15-18.

[19] 马燕,邓炜,田惠桥.芒果花药发育的细胞化学研究[J].广西植物,2011,31(3):338-341.

[20] 尹增芳,樊汝汶.中国鹅掌楸子小孢子发生的细胞化学研究[J].植物学通报,1998,15(3):34-38.

[21] Flint S D, Caldwell M M. Partial inhibition of in vitro pollen germination by simulated solar ultraviolet-B radiation[J]. Ecology,1984，65(3):792-795.

[22] Papini A, Mosti S, Brighigna L. Programmed-cell-death events during tapetum development of angiosperms[J]. Protoplasma,1999,207(3/4):213-221.

Abnormal Changes of Polysaccharides and Lipids Distribution during Pollen Abortion inPopulustomentosaCarr./

Chang Tongjie(Beijing Forestry University, Beijing 100083, P. R. China); Cao Yuan(Chinese Academy of Forestry); Zhang Wenchao, Jing Yanping(Beijing Forestry University)//

Journal of Northeast Forestry University.-2014,42(6).-15～18

PopulustomentosaCarr; Pollen; Abortion; Polysaccharides; Lipids

1) 国家自然科学基金项目(30700636)资助。

常童洁，女，1988年6月生，北京林业大学生物科学与技术学院，硕士研究生。

荆艳萍，北京林业大学生物科学与技术学院，副教授。E-mail：yping@bjfu.edu.cn。

2013年10月15日。

S792.117；S718.47

责任编辑：潘 华。