杨晓春 许建彪 唐罗生

血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)中起着重要的作用，它是DR血管生成和渗漏必不可少的诱导因子，涉及病变的各个阶段[1]。近年研究表明，DR患者体内的一种毒性物质非酶糖基化终产物(advanced glycation end-products，AGE)能促使视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)细胞表达VEGF增加[2]。P44/42 MAPK和PI3K/Akt是两个重要的细胞内信号转导通路，对VEGF的表达具有重要作用[3-4]，但它们是否参与了AGE诱导的RPE细胞外VEGF的表达，目前尚未见相关报道。本文通过研究p44/42 MAPK阻断剂PD98059和PI3K/Akt阻断剂LY294002对AGE诱导的ARPE-19细胞外VEGF表达的影响，探讨AGE诱导VEGF表达的可能机制。

1 材料与方法

1.1材料人RPE细胞株ARPE-19由湖南大学生物实验室惠赠，SP法鉴定，取3-5代细胞用于本实验。无糖DMEM培养液购自Invitrogen公司；胎牛血清(FBS)购自杭州四季青生物工程技术有限公司；PD98059和LY294002购自Sigma公司(美国)；VEGF试剂盒、链霉亲和素-生物素化-过氧化物酶购自武汉博士德生物技术有限公司；兔抗人磷酸化Akt单克隆抗体、鼠抗人磷酸化p44/42单克隆抗体为碧云天生物技术研究所进口分装；羊抗鼠抗兔二抗检测试剂盒购自中杉金桥生物技术有限公司。AGE及AGE对照物的制备同文献[5]。预实验确定试剂浓度及干预时间。

1.2方法实验分为对照组、AGE组(包括时间依赖组、剂量依赖组)、PD98059组、LY294002组和PD98059+LY294002组。人RPE细胞株ARPE-19细胞按100×103个接种于24孔板中，放入经体积分数4%多聚赖氨酸处理的盖玻片，以含体积分数15%FBS的无糖DMEM液培养至80%融合，换不含FBS的无糖DMEM液培养24 h。根据分组分别加入含下述试剂的培养液。

1.2.1AGE处理ARPE-19细胞时间依赖组加入100 mg·L-1AGE，每组在含体积分数5%CO2、37 ℃培养箱中分别培养2 h、6 h、8 h、12 h、24 h。……