白秀娟+卢伙胜+冯波

DOI:10.3969/j.issn.1004-6755.2014.04.001

摘 要：研究了pH、盐度对茂名海域文昌鱼的急性毒性，在水温（25±1） ℃条件下，找出了文昌鱼在高低pH和高低盐度水体中96 h LC50分别为：pH为5和10；盐度为17.5‰和47.5‰。pH和盐度对文昌鱼出砂率和死亡率的影响均呈典型的V字型，影响的方程为二项式方程。文昌鱼出砂率和死亡率与pH值和盐度变化均为高度相关（r＞0.8）。随时间延长，文昌鱼活力降低，体色加深，出砂和死亡数增多。

关键词：文昌鱼；pH；盐度；急性毒性

文昌鱼（Branchiostoma belcheri）隶属于脊索动物门（Phylum Chordata），头索动物亚门（Cephalochordata），终生都保留脊索动物门的三大主要特征——被神经管、脊索和咽鳃裂。是研究脊椎动物起源与演化的关键类群[1-3]。由于其个体小、躯体半透明、体外受精发育等有利条件，是文昌鱼作为进化发育生物学研究的非常理想的模式动物[4]。

盐度是影响水生动物生理状态的主要环境因子之一，包括机体新陈代谢、生长、营养需求等[5]。在高渗或低渗条件下，机体必须消耗一定的额外能量来维持水盐平衡[6]。潮汐、降雨或人类活动都可能导致海水盐度的变化，从而造成水生生物渗透胁迫。盐度胁迫对一些鱼类、虾蟹类研究的报道相对较多[7-9]，有关盐度胁迫对文昌鱼的研究报道却较少，本实验检测了急性盐度胁迫对文昌鱼的影响，旨在为文昌鱼的资源保护提供参考依据。

pH值作为水环境的主要因子，过高或过低都可引起水生生物不适，如引起生物呼吸道、表皮的腐蚀损伤。pH对海水鱼虾类的直接影响表现为酸性过强可使鱼虾血液pH值下降，从而削弱其载氧能力，造成缺氧症，影响虾的矿化作用，而且低pH会增加铁离子、硫离子等物质的毒性；反之，碱性过强的水会加剧水中的氨氮毒害作用[10-11]。其中pH值对氨氮毒性影响最显著[12]。pH值对虾类相关研究较多[13-14]，单独作为一个因子对水生生物的影响的研究相对较少。

文昌鱼生活于温带和热带海洋地区的近海海域，对栖息环境要求相对较高，喜欢干净砂质水底。但随日益增加的工农业污染排放入海，文昌鱼生活的水域水质极易遭到破坏。近年，对茂名海域文昌鱼的生活栖息及生态环境研究日渐报道[15-17]。本文着重研究了pH值对茂名海域文昌鱼的急性毒性。

1 材料与方法

1.1 文昌鱼采集

图1 文昌鱼采集地点

文昌鱼采自广东茂名大放鸡岛海域，采集区域如图1所示。由潜水员携带文昌鱼专用采集器[18](采集面积为0.075 m2)采集泥沙，用套筛分选文昌鱼。将文昌鱼放在装有海水及底砂的水桶中带回实验室。

1.2 文昌鱼暂养

选体长3.60～4.95 cm，体重0.06～0.19 g，性腺未成熟的幼鱼进行实验。采用经曝晒两天的海水，水温（24±1） ℃，盐度（29±1）‰，pH 8.05，NO2-0.07 mg/L，用50 L的水桶，放砂深20 cm左右，砂取自文昌鱼生活海域，暂养时间为一周。期间投喂自己培育的小环藻(Cyclotellasp)、小角毛藻(Chaetocerossp)、双壁藻(Diploneissp)、双眉藻(Amphora ehrenberg)和人工饵料等，并进行微充氧，保证暂养期间海水中的氧含量。

1.3 pH值、盐度校准

试验所需药品速溶海水晶，HCl和NaOH均为分析纯。盐度测定采用校准后的盐度计（CHO-89264MC），pH值校准采用便携式pH计（PHBJ-260）。

1.4 急性毒性实验

试验在体积为20 cm×20 cm×30 cm玻璃缸中进行，每个缸放砂深约7 cm，经曝晒2 d，用50目筛过滤的海水2 L。每玻璃缸放经过暂养一周的文昌鱼8尾，高低各设4个浓度梯度，每个浓度设两个重复。试验期间不充氧，不投喂，时间设为96 h，每隔24 h观察测定一次，如急性毒性实验用水浓度有较大幅度降低，则按照比例进行补充，保证pH、盐度的损失率不超过20%；并记录文昌鱼出砂、活动及死亡情况。

文昌鱼在自然条件下喜将身体的一半埋在沙中，受到干扰或水质恶化时躲藏于砂中；但当砂中的环境条件亦变差时，将会逃离砂，重新回到水中。用玻璃棒轻触，能快速钻砂，定义为活力强；用玻璃棒轻触，能游动，但不能钻砂，定义为活力弱；体色在试验过程中有变红现象，并且随时间延长和浓度增减，体色加深程度增强；用玻璃棒轻触，文昌鱼没有任何反应，定义为文昌鱼死亡。

半致死浓度（LC50）按以下公式[19]略加修改计算（当遇到两个数值都接近50%且与50%差值相同时，按照两个数值分别计算出半致死浓度后取平均值）。

LC50＝C1＋[（P1－50%）/（P1－P2）]×（C2-C1）

C1和 C2分别代表成活率最接近 50％的低端浓度和高端浓度，P1和 P2分别代表低端浓度和高端浓度时的成活率。

2 结果与分析

2.1 pH对文昌鱼的影响

2.1.1 pH对文昌鱼的存活影响 不同时段文昌鱼的存活情况，见表1。

表1 文昌鱼在不同pH值水体中的存活率

项目 不同pH条件下的存活率/%

3.5 4.5 5.5 6.5 8.5 9.5 10.5 11.5

24 h 56.25 75 100 100 100 100 81.25 81.25

48 h 43.75 62.5 87.5 100 100 87.5 81.25 68.75

72 h 37.5 56.25 75 100 100 81.25 62.5 43.75

96 h 6.25 43.75 56.25 100 100 68.75 31.25 6.25

将96 h文昌鱼半数致死的pH定义为96 h LC50，依据半致死浓度计算公式找到文昌鱼 96 h LC50分别为低端pH组中96 h LC50为4.2，高端pH组中96 h LC50为10.1。

经SPSS11.5软件分析，低pH（3.5～6.5）组，各pH组文昌鱼出砂率在24 h时差异显著（P＜005），在其他各时间点文昌鱼出砂率随pH增加差异极显著（P＜0.01）；相同pH组，第24 h时出砂率与其他各时间点出砂率差异极显著（P＜0.01），48 h与72 h时出砂率差异显著（P＜005），96 h时各组出砂率与第48 h和72 h文昌鱼出砂率与差异极显著（P＜0.01）。

高pH（8.5～11.5）组， 24 h时，各pH组随pH增加文昌鱼出砂率差异显著（P＜0.05），其他各时间点文昌鱼出砂率随pH增加差异极显著（P＜0.01）。相同pH组，第24 h与48 h文昌鱼出砂率差异不显著（P＞0.05），与72 h文昌鱼出砂率差异显著（P＜0.05），与96 h出砂率差异极显著（P＜0.01）；第48 h与72 h和96 h文昌鱼出砂率差异显著（P＜0.05），第72 h与96 h文昌鱼出砂率差异显著（P＜0.05）。

2.1.2 文昌鱼出砂率和pH关系 文昌鱼出砂率和pH的相关关系，见图2。

图2 文昌鱼出砂率和pH相关关系

表2 文昌鱼出砂率与水体中pH值相关方程

项目 24 h 48 h 72 h 96 h

二项式方程 Y＝-2.31 x2－36.68

x+140.91 Y＝2.87 x2－45.66

x+180.57 Y＝3.79 x2－57.81

x+222.32 Y＝5.87 x2－88.09

x+333.85

R2 R2＝0.8825 R2＝0.9553 R2＝0.9545 R2＝0.9325

文昌鱼出砂率与pH值基本呈V形变化。在pH 介于3.5～8.5时，文昌鱼出砂率随pH增加呈下降趋势；pH 介于8.5～11.5之间时，文昌鱼出砂率随pH增加呈上升趋势。

2.1.3 文昌鱼出砂率与水体中pH值相关分析 文昌鱼出砂率与水体中pH值相关方程见表2。各时段不同pH值组文昌鱼出砂率随pH值增加呈二项式相关，且相关程度较高，说明文昌鱼出砂率与pH值变化高度相关（r＞0.8）。

2.2 盐度对文昌鱼的急性毒性

2.2.1 盐度对文昌鱼的存活影响 盐度对文昌鱼的存活影响见表3。

表3 文昌鱼在不同盐度组96 h的存活率

项目 不同盐度条件下的存活率/%

10‰ 15‰ 20‰ 25‰ 35‰ 40‰ 45‰ 50‰

24 h 68.75 81.25 100 100 100 100 81.25 81.25

48 h 56.25 75 87.5 100 100 93.75 81.25 56.25

72 h 43.75 56.25 75 100 100 81.25 62.5 43.75

96 h 6.25 31.25 68.75 100 100 75 56.25 31.25

经计算，文昌鱼96 h LC50低盐度组为176‰，高盐度组为45.7‰。

经SPSS11.5软件分析，低盐度组（10‰～25‰），文昌鱼出砂率和其盐度相关性差异显著（P＜0.05）或极显著（P＜0.01）；各盐度组相同时间对比，文昌鱼出砂率随盐度变化差异极显著（P＜001）。在高盐度组（35%～50‰），各盐度组文昌鱼出砂率在24 h时差异显著（P＜0.05），其他时间段文昌鱼出砂率差异极显著（P＜0.01）；同一盐度组24 h与72 h以及72 h与96 h对比，文昌鱼出砂率差异显著（P＜0.05），第48 h与72 h各盐度组文昌鱼出砂率差异不显著（P＞0.01）；其他各组文昌鱼出砂率差异极显著（P＜0.01）。

2.2.2 文昌鱼出砂率与盐度关系 文昌鱼出砂率与盐度关系，见图3。

图3 文昌鱼出砂率与盐度关系图文昌鱼出砂率与盐度呈V字型，在盐度10‰～35‰之间，文昌鱼出砂率与盐度呈负相关，盐度越高，文昌鱼出砂率随盐度增高而降低；盐度介于35‰～50‰之间，文昌鱼出砂率与盐度呈正相关，盐度越高，出砂率越高；时间越长，出砂率越高。

2.2.3 文昌鱼出砂率与盐度相关分析 如表4，在各个时间点，盐度介于10‰～50‰之间时，文昌鱼出砂率与盐度呈二项式相关，且出砂率与盐度呈高度相关（r＞0.8）。

表4 文昌鱼出砂率与盐度相关方程

项目 24 h 48 h 72 h 96 h

二项式方程 Y＝-0.16 x2－10.02

x+160.22 Y＝0.19 x2－11.77

x+195.39 Y＝0.2 x2－12.2

x+209.46 Y＝0.2 x2－12

x+218.71

R2 R2＝0.9041 R2＝0.8289 R2＝0.8311 R2＝0.642

3 讨论

在实验中发现，当水体中环境不利于文昌鱼时，文昌鱼会从沙中爬出，当中毒较深时，文昌鱼已经无力钻进沙中，只能呆在水中，用玻璃棒轻轻触动文昌鱼身体，文昌鱼也只能轻轻摆动一下身体，无力游动，此时文昌鱼体色变成深红色，且有部分腐烂，这样漂浮一到连天即死亡。我们以出砂作为中毒较浅的指标，把死亡作为中毒较深的指标，以此来判定文昌鱼受环境条件影响的程度。

在高渗或低渗条件下，鱼机体必须消耗一定的额外能量来维持水盐平衡[20]，长时间的低盐度胁迫可能导致细胞持续受损[21]，推测盐度胁迫对鱼体的免疫系统有一定的抑制作用[22]。在盐度25‰～35‰范围内未出现文昌鱼出砂或死亡现象，说明此范围比较适合文昌鱼生活，这与在自然海域中军曹鱼成鱼分布于盐度22.5‰～44.5‰水体中[9]颇为相近。在盐度超过35‰时，海水中氧的溶解度随温度、盐度增加而降低[23]，溶解氧的改变会影响到水体其他环境因子的变化，这在一定程度上降低了文昌鱼的耐受性，从而使文昌鱼出砂率大大增高，而存活率明显降低。文昌鱼耐受盐度的96 h LC50低值为17.6‰，略高于施氏鲟96 h LC50的1472‰和西伯利亚鲟的1308‰[24]，鲟作为脊椎动物门的古老的物种，而文昌鱼作为脊索动物门的代表，从耐受低盐的能力上看出脊椎动物门的耐受性还是强于脊索动物门的耐受能力的。

pH值适合时，耗氧率较低；而在pH值不适合时，鱼体表现出不适应，将通过改变代谢状况，消耗较多的能量以适应外界环境，表现为增大了蛋白质的代谢比例，造成耗能增大、耗氧率升高[25]。水体中 pH 的变化会对离体组织的呼吸产生显著影响，尤其是对离体鳃组织每单位呼吸面积的影响更显著[26]。文昌鱼在pH值低于6.5或高于8.5时，表现为出砂，不停地游动、翻滚等躁动的现象，pH值越低或越高，这些表现越明显，不停地游动势必消耗大量的能量，需要的耗氧量增大；而pH的改变使文昌鱼的呼吸受到严重影响，降低了呼吸效率，使供氧不足，导致出砂和死亡现象。在pH介于65～8.5之间时，未出现出砂和死亡现象，说明此范围比较适宜文昌鱼生活。文昌鱼耐受高低pH的96 h LC50分别为4.2和10.1，这比中国林蛙[27]耐受pH的高低值（107和3.6）略低，可能也是由于所属分类地位不同所致。

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Acute toxicity of pH and salinity on Branchiostoma belcheri

BAI Xiu

________________________________________

Juan，LU Huo

________________________________________

Sheng，FENG Bo

(Fisheries College, Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524088, China)

Abstract：This experiment was conducted to study The acute toxicity of pH and salinity on the Branchiostoma belcheri . To find the 96 h LC50 of Branchiostoma belcheri in the water of pH and salinity .The results showed that the limit of Branchiostoma belcheri in the water of pH and salinity . In the pH water the 96 h LC50 is 5 and 10 ; and in the salinity the 96 h LC50 is 17.5‰ and 47.5‰.The influence of pH and salinity to the rate of out of sand and death rate is V. The effect of equation is binomial equation. The rate of out of sand with the change of salinity and the death rate with the change of salinity are height（r＞0.8）. The lively of Branchiostoma belcheri got much lower，their colour got darken, and the Branchiostoma belcheri got out of sand and death more and more.

Key words：Branchiostoma belcheri; pH; salinity; The acute toxicity

（收稿日期：2014-01-21；修回日期：2014-01-27）

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Acute toxicity of pH and salinity on Branchiostoma belcheri

BAI Xiu

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Juan，LU Huo

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Sheng，FENG Bo

(Fisheries College, Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524088, China)

Abstract：This experiment was conducted to study The acute toxicity of pH and salinity on the Branchiostoma belcheri . To find the 96 h LC50 of Branchiostoma belcheri in the water of pH and salinity .The results showed that the limit of Branchiostoma belcheri in the water of pH and salinity . In the pH water the 96 h LC50 is 5 and 10 ; and in the salinity the 96 h LC50 is 17.5‰ and 47.5‰.The influence of pH and salinity to the rate of out of sand and death rate is V. The effect of equation is binomial equation. The rate of out of sand with the change of salinity and the death rate with the change of salinity are height（r＞0.8）. The lively of Branchiostoma belcheri got much lower，their colour got darken, and the Branchiostoma belcheri got out of sand and death more and more.

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（收稿日期：2014-01-21；修回日期：2014-01-27）

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Acute toxicity of pH and salinity on Branchiostoma belcheri

BAI Xiu

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Juan，LU Huo

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Sheng，FENG Bo

(Fisheries College, Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524088, China)

Abstract：This experiment was conducted to study The acute toxicity of pH and salinity on the Branchiostoma belcheri . To find the 96 h LC50 of Branchiostoma belcheri in the water of pH and salinity .The results showed that the limit of Branchiostoma belcheri in the water of pH and salinity . In the pH water the 96 h LC50 is 5 and 10 ; and in the salinity the 96 h LC50 is 17.5‰ and 47.5‰.The influence of pH and salinity to the rate of out of sand and death rate is V. The effect of equation is binomial equation. The rate of out of sand with the change of salinity and the death rate with the change of salinity are height（r＞0.8）. The lively of Branchiostoma belcheri got much lower，their colour got darken, and the Branchiostoma belcheri got out of sand and death more and more.

Key words：Branchiostoma belcheri; pH; salinity; The acute toxicity

（收稿日期：2014-01-21；修回日期：2014-01-27）