陈 蕾， 熊红珍， 邹 川

(1.广东省口腔医院牙体牙髓科，广东 广州 510280;2.广东省中医院肾内科，广东 广州 510120)

粪肠球菌(Enterococcus faecalis)为革兰阳性兼性厌氧菌，属于人体的正常菌群，是顽固性或继发性根管内感染的主要致病菌.在营养物质缺乏、高碱性的恶劣环境中能长期生存，并形成再感染，该菌在根管治疗失败的过程中扮演着十分重要的角色［1］.此外，粪肠球菌对磺胺类、头孢菌素低水平的氨基糖苷类等药物具有天然的耐药性，而且对于人们使用的抗生素，可通过接受外来耐药基因质粒和转座子，或通过基因突变来获得耐药性［2］.目前，根管治疗中常规的机械预备和冲洗消毒方法并不能完全清除已定植于根管中的粪肠球菌.本课题小组前期研究发现，中药复方提取液:黄芩、大黄、五倍子、蛇床子对难治性慢性根尖周炎的优势菌群有良好的抗菌效果［3］.本实验进一步探讨上述中药复方以及4种单味药对粪肠球菌超微结构的影响.

1 材料和方法

1.1 材料

菌种准备和细菌培养将由中山大学光华口腔医学院微生物室提供粪肠球菌ATCC 29212，接种于脑心浸液 (brian heart infusion，BHI)培养基，37℃复苏培养48 h.培养至血平板上可划出单个菌落时，用接种环挑取1个典型菌落，在载玻片上涂片、烘干，采用革兰氏染色法对细菌涂片进行染色，显微镜下观察细菌的形态和结构特征.经纯化鉴定后［4］，采用麦氏比浊法用磷酸盐缓冲液pH=7.2配成细菌混悬液(1.0×109CFU/mL).

1.2 方法

(1)中药复方提取液的配制 各取200 g原药材:黄芩、大黄、五倍子、蛇床子，除去虫垢及杂质，冲洗清洁、干燥，粉碎后过28目筛，称取50 g，加无离子水100 mL，室温下浸泡24 h，过滤离心，取上清液，共两次.上清液进行浓缩并冷冻干燥，所得干粉视为药材水提取物纯品.黄芩、大黄、五倍子、蛇床子4种中药干粉分别制成质量浓度为0.2 g/mL水提液，并按1∶1∶1∶1 配制成质量浓度为 0.2 g/mL 中药复方提取液.

(2)菌株准备和操作步骤 菌株复苏培养并活化鉴定后使用4℃生理盐水对细胞进行离心漂洗1～2次，800～1 500 r/min离心5 min;将洗涤干净的菌株，用生理盐水制备1.0×109CFU/mL细菌悬液，分装6个试管，每管细菌10 mL，1 500 r/min离心5 min，弃去上清液;实验管细菌沉淀中分别加入质量浓度为0.2 g/mL中药复方、黄芩、大黄、五倍子和蛇床子提取液各10 mL，阴性对照管细菌沉淀中加生理盐水10 mL;摇开沉物混匀，37℃下处理15 min;在药物处理和对照组菌液中分别加入少量血清，1 500 r/min离心5 min，使细菌黏结，弃去上清液.

用4℃生理盐水对细胞进行离心漂洗1～2次，800 ～1 500 r/min离心 5 min;使用1 500 μL Eppendorf(EP)管将漂洗好的细胞在1 500～2 000 r/min离心10 min，成肉眼可见的约0.5～1 mm高细胞团块，切勿超出1.5 mm，贴壁加入500 μL 4℃ 体积分数为2.5%戊二醛，避免震荡;于4℃冰箱静置3 d.

(3)超薄切片制备过程 清洗:PBS缓冲液漂洗5次，每次15 min.固定:体积分数为1%锇酸4°C 1 h.清洗:PBS缓冲液冲洗3次，每次15 min.脱水:弃溶液，分别加入体积分数为30%、50%、70%、90%丙酮15 min，摇动EP管，使容器周壁及上盖均接触到丙酮;弃溶液，加入体积分数为100%丙酮脱水3次，每次15 min，摇动玻璃瓶或EP管，使容器四周及上盖均接触到丙酮.浸渍:弃溶液，加入V树脂∶V丙酮=1∶1，静置2 h;弃溶液，加入 V树脂∶V丙酮=2∶1，静置4 h;弃溶液，加入树脂过夜;包埋:将的树脂和标本转移到相应包埋板中，加入标签，待标本下沉至包埋板底部，放入烤箱;聚合60℃聚合，72 h;超薄切片(60～70)nm;空气干燥过夜;染色:醋酸双氧铀20 min，水洗3次，每次5 min;柠檬酸铅10 min，水洗3次，每次5 min;空气干燥4 h以上.

(4)透射电镜观察 采用Hitach 7500型透射电镜观察粪肠球菌在中药处理后超微结构基本病理变化.

2 结果

2.1 粪肠球菌纯化培养

粪肠球菌进行复苏、纯培养后，在琼脂平皿上呈现乳脂状的白色或灰白色菌落，边缘整齐，凸起、不透明、有光泽、表面光滑，直径(1.0 ～2.0)mm，表现为α或β性溶血.经菌落形态、菌体革兰氏染色及生化反应鉴定，结果均符合粪肠球菌手册鉴定特性，即呈圆形或椭圆形革兰阳性球菌，直径(0.5～1.0)μm，大多数成对或短链状排列，菌体周围无鞭毛和芽孢，无运动特性，触酶阴性，发酵乳糖，不发酵阿拉伯糖.

2.2 中药复方提取液和单味药对粪肠球菌超微结构的影响

黄芩组:胞壁较完整，胞浆稍微变性，胞浆内容物聚集成深黑色团块沉淀，胞内出现空泡较小，没有或少量细胞内容物外排(图1).

大黄组:大部分胞壁不完整，破裂呈不连续状态，质壁分离严重，胞浆内可见大量颗粒样黑色沉淀(图2).

五倍子组:胞壁完整，胞浆完整，胞膜表面有短小突起，核浆比大，细胞器少，出现较小空泡(图3).

蛇床子组:胞壁变薄，胞浆变性严重，胞浆内容物聚集成深黑色团块沉淀，胞内出现空泡，有少量细胞内容物外排(图4).

中药复方组:胞壁变薄或消失，细胞变形，出现裂解或自溶状态，核浆消失，大量细胞内容物外排(图5).

正常对照组:胞壁完整，包浆完整，胞膜表面有短小突起，核浆比大，细胞器少(图6).

图1 黄芩组粪肠球菌的超微结构改变(×80 000)Fig.1 The ultramicrostructure changes of Enterococcus faecalis in Radix Scutellariae group(×80 000)

图2 大黄组粪肠球菌的超微结构改变(×80 000)Fig.2 The ultramicrostructure changes of Enterococcus faecalis in Radix et Rhizoma Rhei group(×80 000)

图3 五倍子组粪肠球菌的超微结构改变(×80 000)Fig.3 The ultramicrostructure changes of Enterococcus faecalis in Galla chinensis group(×80 000)

图4 蛇床子组粪肠球菌的超微结构改变(×80 0000)Fig.4 The ultramicrostructure changes of Enterococcus faecalis in Cnidium monnieri group(×80 000)

图5 中药复方组粪肠球菌的超微结构改变(×80 000)Fig.5 The ultramicrostructure changes of Enterococcus faecalis in Herbal compound group(×80 000)

图6 正常对照组粪肠球菌的超微结构改变(×80 000)Fig.6 The ultramicrostructure changes of Enterococcus faecalis in Negative control group(×80 000)

3 讨论

有研究提示，黄芩、大黄、五倍子、蛇床子对初次牙髓感染的根管中检出率较高的牙龈卟啉单胞菌抗菌效果明显［5］.而作为顽固性或继发性根管内感染的主要致病菌，粪肠球菌可以饥饿状态在恶劣的环境中长期生存，在牙齿根管充填后的顽固性根尖周感染中常被检出［1］.

黄芩(Radix Scutellariae)对革兰氏阴性的细菌如牙龈卟啉单胞菌，有较强的抑杀作用［5］，能使菌体蛋白和酶变性、沉淀，溶解胞浆［6］.但充分发挥需要药物穿透菌体细胞壁.对于细胞壁较厚的粪肠球菌，黄芩的抑菌效果相对较弱［7］.本研究结果显示，透射电镜下可见经黄芩处理后的粪肠球菌大多数菌体细胞壁较完整，没有或少量细胞内容物外排，胞浆轻度变性，个别胞浆内出现空泡.可能与黄芩苷等活性物质对细菌壁的结合作用较低，穿透粪肠球菌细胞壁的作用有限有关.

中药大黄(Radix et Rhizoma Rhei)主要成分大黄蒽醌衍生物，对各种细菌都具有明显的抑菌作用.扫描电镜下可见经大黄处理后的粪肠球菌大部分胞壁不完整，破裂呈不连续状态，质壁分离严重，胞浆内可见大量颗粒样黑色沉淀.根据本实验研究结果，大黄的抗菌特点为:破坏菌体的细胞壁，增强细胞通透性，使胞浆蛋白沉淀.与多位学者的研究结果基本一致［7-9］，大黄对粪肠球菌具有较强的抑杀作用，其作用机制可能是大黄素可以破坏细菌细胞膜的通透性，抑制菌体内的蛋白质合成［10］.

五倍子(Galla chinensis)水提取物通常被认为抗菌效果较好且广泛［11］，通过抑制细菌产生水不溶性胞外多糖的关键酶—葡萄糖基转移酶的活性［12］，抑制菌斑胞外基质生成［13］.本课题小组前期研究也发现五倍子能沉淀牙龈卟啉单胞菌的胞浆蛋白，使厌氧菌的胞浆出现大量颗粒样黑色沉淀和较多空泡.但本实验结果显示，五倍子对粪肠球菌的抗菌效果有限，镜下见绝大多数细胞壁、细胞浆完整，仅个别胞浆出现较小空泡.这可能与革兰阳性的粪肠球菌细胞壁较厚，五倍子渗透能力相对较弱［14］，鞣质难以进入胞浆发挥其收敛作用.

经蛇床子(Cnidium monnieri)处理后的粪肠球菌胞壁变薄，胞浆变性严重，胞浆内容物聚集成深黑色团块沉淀，胞内出现空泡，有少量细胞内容物外排.此外，蛇床子对水不溶性葡聚糖合成抑制超过40%，能减少细菌生物膜胞外基质的产生［15］.

本研究结果显示:中药复方组粪肠球菌的细胞壁失去原有结构而明显变薄或消失，细胞变形，出现裂解或自溶状态，核浆消失，大量细胞内容物外排.提示中药复方抗粪肠球菌的生物学作用较单味药更显著，作用于菌体细胞的机制可能为:大黄、蛇床子可以破坏细胞壁结构，干扰细菌胞膜物质转运、阻碍能量转换和信息传递;从而有利于黄芩、五倍子进入菌体内，发挥进一步的抗菌活性，如使蛋白和酶变性或沉淀，溶解胞浆;抑制胞外基质的生物合成等.

本研究提示，中药复方对口腔致病粪肠球菌具有一定的抗菌效果，但其具体作用机制和量效关系还不明确，尚有待进一步研究.

［1］ 宁 杨，凌均棨.饥饿状态的粪肠球菌的研究进展［J］.国际口腔医学杂志，2012(4):461-463.

［2］ 狄婷婷，高 原.粪肠球菌研究进展［J］.中国公共卫生，2012(11):1530-1532.

［3］ 陈 蕾，叶小雅，魏碧红.中药复方提取液对难治性慢性根尖周炎根管壁细菌的影响［J］.广东牙病防治，2010，18(9):451-454.

［4］ 肖晓蓉，周学东.口腔微生物学［M］.成都:四川大学出版社，1993.

［5］ 陈 蕾，熊红珍.中药复方对牙龈卟啉单胞菌内毒素及超微结构的影响［J］.广东牙病防治，2013，21(9):456-460.

［6］ 张 良，唐荣银，杨 斌.五倍子、黄芩提取物对牙龈卟啉菌超微结构的影响［J］.牙体牙髓牙周病学杂志，2008，18(9):515-517.

［7］ 于 静，戴东晓，谢景朝，等.黄连等中药水煎剂对粪肠球菌的体外抑制作用［J］.河北医药，2012(17):2580-2582.

［8］ 于 静.大黄对感染根管内粪肠球菌的体外抑制作用实验研究［J］.河北中医药学报，2012(3):44-45.

［9］ 王贵花，徐运强，王荣霞.中药水煎剂对粪肠球菌感染根管体外抑菌试验的探讨［J］.中医药信息，2012(1):115-117.

［10］ 周 磊，云宝仪，汪业菊，等.大黄素对金黄色葡萄球菌的抑菌作用机制［J］.中国生物化学与分子生物学报，2011(12):1156-1160.

［11］ 刘 进，唐荣银，杨巨才.五倍子对感染根管内厌氧菌抑制作用的体外研究［J］.牙体牙髓牙周病学杂志，2005，15(5):270-273.

［12］ WOLINDKY L E，SOTE E O.Isolation of natural plaqueinhibiting substances from ‘Nigerian chewing sticks’［J］.Caries Research，1984，18(3):216-225.

［13］ 李 红，李继遥，朱 昞，等.五倍子对牙菌斑生物膜细菌生长代谢的研究［J］.中国中药杂志，2005，30(21):1685-1688.

［14］ 冯雅君，王 鑫，李文静，等.五倍子水煎剂对粪肠球菌的抑制作用［J］.河北医药，2012(6):830-832.

［15］ 李鸣宇，朱彩莲，刘 正.天然植物提取物对变链菌胞外多糖的抑制［J］.现代口腔医学杂志，2004，18(6):481-482.