李 炯， 黄鸿兴， 王鹏程， 江振友

(暨南大学医学院微生物与免疫系，广东 广州 510632)

近年来，随着广东等沿海地区工业的快速发展，大量未经处理的工业污水排入沿海海域，污水中含有的重金属离子可随着食物链富集到贝类等水生生物体内.贝类产品更易受水源污染的影响，其卫生质量对人类的健康具有重要影响，也越来越引起人们的重视.重金属铅及其化合物具有蓄积性和多亲和性等特点，可以通过呼吸道、消化道等途径侵入机体，从而引起机体神经系统功能或结构损害，长期摄入铅会引起消化系统和神经系统等疾病 .因此，建立快速而灵敏的重金属离子检测的分析方法是一项非常紧迫的任务.常见的用于重金属离子检测的技术包括酶分析法、电感耦合等离子发射光谱法、原子荧光光度法、高效液相色谱法、电感耦合等离子体质谱法、生物传感器以及免疫分析法等［3］.尽管这些常规检测方法精密度和准确度较高，但存在操作复杂、仪器昂贵、耗时较长及检测成本高等缺点.方波伏安法因其具有快速、成本低、灵敏度高和选择性好等特点已被广泛用于疾病相关的生物标志物、环境污染物(如重金属和其他化学污染物)的检测［4-5］.已有文献报道采用方波伏安法检测水体、空气以及农药等铅离子含量，然而对食用的贝类重金属含量的研究则很少报道［6-10］.本研究选取市场上常见的4种贝类作为研究对象，采用方波溶出伏安法测定贝类中铅元素的质量分数，评估其食用的安全性.

1 材料与方法

1.1 实验材料

CHI832C电化学工作站(上海辰华仪器公司);电感耦合等离子体发射光谱仪(美国PerkinElmer公司，Optima2000DV);pH计(上海仪电科学仪器股份有限公司);电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司);涡旋振荡器(北京京辉凯业科技有限公司);玻碳电极(上海辰华仪器公司);氯化钾(≥99.99%，Sigma公司);铅标准储备液(1 000 μg/mL，广州自力色谱科仪有限公司);高氯酸(AR，上海实意化学试剂有限公司);浓硝酸(AR，广州自力色谱科仪有限公司);硝酸汞(AR，广州自力色谱科仪有限公司);实验用水为R=18 MΩ/cm的超纯水.

1.2 实验方法

(1)试剂配制 配制500 mL HAc-NaAc缓冲液(0.2 mol/L，pH=5.6 和 5.0);镀汞液:40 mg/L 的氯化汞溶液+0.03 mol/L稀盐酸(调 pH至5.0);铅标准液:取1.00 mL铅标准储备液(1 mg/mL)于100 mL容量瓶中，然后用超纯水定容至100 mL，得到10 mg/L的铅标准液.

(2)样品处理 本实验测试样品来源于广州某农贸市场随机购买的4种贝类:齿舌栉孔扇贝(Chlamys radla)，毛蚶(ScapHarca subcrenata)，近江牡蛎(Ostrea rivularis)，翡翠贻贝(Perna viridis).样品处理采用湿法消化［11-12］，具体步骤:配制硝酸+高氯酸混合酸(按体积比9∶1配制)，准确称量贝类样品置于100 mL锥形瓶中，加入10 mL混合酸在电炉上加热消化5～10 min.待溶液呈无色透明状且有白烟冒出，停止加热.将消化液转移至25 mL容量瓶中并用醋酸缓冲液定容至25 mL，作为待检测液.准确移取一定量待检测液于电解池中并用醋酸盐缓冲液定容至10 mL，按实验优化参数进行测定，并在标准曲线上求出待测液中Pb2+的浓度.

(3)玻碳电极的预处理 首先用 1、0.3、0.05 μm粒径的Al2O3打磨玻碳电极约4 min，然后用超纯水清洗干净电极，最后将电极分别放在无水乙醇，蒸馏水中交替超声清洗5 min，氮气吹干备用.

(4)方波伏安检测参数的优化为提高检测灵敏度，在对玻碳电极进行方波伏安扫描的过程中，需对方波频率、扫描速度、沉积电压，方波振幅和电沉积时间参数进行优化.参考相关文献［13-14］，首先设定方波伏安检测参数:方波频率(30 Hz)、扫描速度(4 mV)、沉积电压(-1.2 V)、方波振幅(30 mV)和电沉积时间(90 s)，然后通过控制变量法分别改变方波伏安各检测参数并获得方波伏安检测最优参数.

(5)方波伏安检测 SWV检测前玻碳电极预镀汞膜(在-1.0 V下电沉积120 s).SWV检测采用三电极系统:工作电极为玻碳电极;参比电极为饱和甘汞电极;辅助电极为铂丝电极.方波伏安(SWV)优化检测程序:在 -1.1 V(vs.SCE)下电沉积120 s，同时以800 r/min搅拌溶液.电沉积结束后停止搅拌并保持电压不变10 s.方波扫描:扫描速度为4 mV(vs.SCE)，振幅为25 Hz，频率为 25 Hz，扫描电位为-1.0 ～ -0.3 V(vs.SCE).

2 结果与分析

2.1 电解质缓冲底液pH选择

在方波伏安法检测金属离子时，缓冲底液峰电流有较大影响，所以有必要对缓冲液的pH值进行优化.首先，分别选择不同pH的0.2 mol/L的HAc-NaAc缓冲液作为缓冲底液对7×10-8mol/L的Pb2+进行方波伏安检测，结果显示HAc-NaAc缓冲液在pH 5.0附近能产生更大的峰电流，且峰型尖锐而对称.所以本实验标准品检测选择0.2 mol/L的HAc-NaAc缓冲液(pH=5.0)作为缓冲底液，贝类样品检测选择由0.2 mol/L的HAc-NaAc缓冲液(9.5 mL，pH=5.6)与贝类样品液(0.5 mL，pH=0.43)组成的混合液(10 mL，pH=5.0)作为缓冲底液.结果见图1.

图1 pH对Pb2+峰电流影响Fig.1 Influence of pH on the peak current of Pb2+

2.2 方波伏安检测参数的优化

采用控制变量法对方波伏安检测参数进行优化，由图2(A)、(B)可知随方波频率和扫描速度的增大，铅离子峰电流信号随之增大，但方波频率和扫描速度的增大会导致半峰宽增加，峰电位负移，不利于铅离子测定，参考相关文献［13］选择方波频率和扫描速度分别为25 Hz，4 mV;图2(C)表示沉积电位在-1～-1.5 V，沉积电位越负峰电流越大.由于电压更负容易出现析氢、杂质氧化等干扰现象，所以选择-1.1 V作为沉积电位;图2(D)表示方波振幅在10～25 mV峰电流随方波振幅增加而增加，振幅在超过25 mV后峰电流增加趋于稳定，方波振幅在25 mV处峰型尖锐而对称，故选择25 mV作为本实验方波振幅;图2(E)表示电沉积时间在60～360 s，峰电流随着电沉积时间增加而增加，沉积时间不足会降低灵敏度，综合灵敏度与节约检测时间考虑，选择120 s作为本实验电沉积时间.

图2 方波溶出伏安法检测条件优化Fig.2 Optimum experimental conditions of square wave stripping voltammetry

优化后，得到方波伏安检测参数如表1:

表1 仪器工作参数Table1 Instrument operating parameters

2.3 溶出方波伏安图

图3 为优化条件下，pH5.0、浓度 0.2 mol/L 的HAc-NaAc缓冲液溶出方波伏安图.可以看出在-0.561 V(vs.SCE)处峰型尖锐且对称，适合用于铅离子的测定.

2.4 线性范围和检出限

在上述最佳条件下，Pb2+浓度(Cpb)在1×10-8～2×10-6mol/L与方波伏安溶出峰峰电流(Ip)呈现良好的线性关系，其回归方程为:IPb=2.497 3+80.93 × CPb，相关系数 r=0.997 7，检出限为 0.267 μg/L(S/N=3).任取7支电极对4×10-7mol/L的含铅溶液进行7次平行实验，响应值的相对偏差(RSD%)为 2.09%(见图3).

图3 不同浓度Pb2+的方波伏安图Fig.3 Different concentrations of Pb2+square wave voltammetry

2.5 可行性实验

为了考察该传感器的实际性能，采用本方法探测了齿舌栉孔扇贝、毛蚶、近江牡蛎和翡翠贻贝4种贝类中Pb2+离子的含量，并以原子吸收和电感耦合等离子体原子发射光谱法(Inductive Coupled Plasma Emission Spectrometer，ICP)作比较.结果显示，本方法与原子吸收方法和ICP的相对偏差为2.30% ～10.91%，表明该传感器能有效地进行Pb2+的检测(见表2).

图4 Pb2+的浓度与峰电流的拟合图Fig.4 The corresponding calibration curve of the peak currents and the concentrations of Pb2+

表2 3种方法检测贝类样品结果比较Table2 The results of the three methods compare shellfish samples

2.6 精密度实验

取处理好的如下3种贝类样品，采用相同的检测条件各重复检测8次，计算均值和相对标准偏差.结果表明相对标准偏差为1.38% ～2.45%(见表3).

表3 3种贝类样品精密度实验检测结果Table3 The precision results of three kinds of shellfish samples (mg/kg)

2.7 回收率实验

准确移取已知质量浓度的0.5 mL样品溶液于电解池中，加入铅标准溶液0.1 mL(质量浓度10 mg/L)并选择HAc-NaAc缓冲液(pH=5.6)定容至10 mL，本实验选择毛蚶样品为代表做回收实验，按试验方法测定.结果表明本方法的回收率为94.63% ～ 101.30%(n=3)，所构建的传感器能够满足检测要求(见表4).

表4 贝类样品铅离子回收实验结果(mg/kg)Table4 Shellfish sample lead ion recycling experimental results (mg/kg)

2.8 干扰离子的影响

在最优实验条件下，向1×10-6mol/L的Pb2+离子标准溶液中分别加入不同浓度的下列干扰离子:K+、Ca2+、Na+、Mg2+、Hg2+.结果表明，当上述离子为Pb2+离子浓度的1 000倍时，仍不影响Pb2+的测定.而Cd2+，Cu2+达到Pb2+离子浓度100倍时便会干扰Pb2+的测定.

3 结论

本实验通过方波溶出伏安法对贝类样品中的铅离子进行检测，结果表明 Pb2+在1×10-8～2×10-6mol/L溶出峰电流与铅离子浓度呈现良好的线性，回归方程 IPb=2.497 3+80.93 × CPb，(r=0.997 7)，检出限达到 0.267 μg/L.该实验所建立的方法操作简便，设备低廉，线性范围宽，重复性和准确性好，大大降低了海产品中铅、铬等金属离子测定的时间和费用.该方法还可用于其他食品中多种重金属离子的检测，具有很好的推广和使用价值.

［1］ 王心如.毒理学基础［M］.北京:人民卫生出版社，2003:249-250.

［2］ 秦俊法，李增禧，李凤芝.微量元素铅与人［M］.郑州:河南医科大学出版社，2001:16.

［3］ 姚振兴，辛晓东.重金属检测方法的研究进展［J］.分析测试技术与仪器，2007，17(1):29-35.

［4］ CHEN A，BADAL SHAH.Electrochemical sensing and biosensing based on square wave voltammetry［J］.Analytical Methods，2013，5:2158-2173.

［5］ FARGHALY O A，GHANDOUR M A.Square-wave stripping voltammetry for direct determination of eight heavy metals in soil and indoor-airborne particulate matter［J］.Environmental research，2005，97(3):229-235.

［6］ CHEN L，LI Z，MENG Y，et al.Sensitive square wave anodic stripping voltammetric determination of Cd2+and Pb2+ions at Bi/Nafion/overoxidized 2-mercaptoethanesulfonate-tethered polypyrrole/glassy carbon electrode［J］.Sensors and Actuators B:Chemical，2014，191:94-101.

［7］ LI Z，CHEN L，HE F，et al.Square wave anodic stripping voltammetric determination of Cd2+and Pb2+at bismuth-film electrode modified with electroreduced graphene oxide-supported thiolated thionine［J］.Talanta，2014，122:285-292.

［8］ MHAMMEDI M A E.Square Wave voltammetry for analytical determination of cadmium in natural water using Ca10(PO4)6(OH)2-Modified platinum electrode［J］.A-merican Journal of Analytical Chemistry，2010，1(3):150-158.

［9］ HE X，CHEN L，XIE X，et al.Square wave anodic stripping voltammetric determination of lead(II)using a glassy carbon electrode modified with a lead ionophore and multiwalled carbon nanotubes［J］.Microchimica Acta，2011，176(1-2):81-89.

［10］ SEENIVASAN S，MANIKANDAN N，MURALEEDHARAN N N，et al.Heavy metal content of black teas from south India［J］.Food Control，2008，19(8):746-749.

［11］ GB 5009.12-2010，食品安全国家标准［S］.

［12］ 汪 慧，邹永德，唐 勇，等.禽畜肉中重金属铜、铅、镉的稀酸浸提方法［J］.暨南大学学报:自然科学与医学版，2014，35(1):1-7.

［13］ ZHANG H，JIANG B，XIANG Y，et al.DNAzyme-based highly sensitive electronic detection of lead via quantum dot-assembled amplification labels［J］.Biosensors and Bioelectronics，2011，28:135-138.

［14］ 李 炯，江振友，黎贞燕，等.基于方波溶出伏安法同时检测贝类样品中痕量的铅、镉［J］.中国科技论文在线，2014，3:1-8.

［15］ Codex A limentarius.Cdeox stan 193-1995 codex general standard for contaminants and toxins in food and feed［S］.

［16］ GB18406.4-2001，农产品安全质量.无公害水产品安全要求［S］.